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HPLC-Analytik nach DAB-Monografie

Cannabinoid-Wirkstoffprüfung: Legal zu guten Peaks

| Autor/ Redakteur: Dr. Stefan Vosskötter* / Dr. Ilka Ottleben

Regulierte Methoden aus Arzneibüchern und Normen zu ändern, ist nicht erlaubt. Leider resultieren ältere Methoden jedoch oft in schlechten Peakformen. Die Deutsches Arzneibuch (DAB)-Monografie Cannabis flos zur Wirkstoffanalytik von medizinischem Cannabis ist ein Beispiel. (Legal) helfen kann hier die Co-Injektion.

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Abb. 1: In Deutschland ist medizinisches Cannabis seit dem 1. März 2017 verschreibungsfähig
Abb. 1: In Deutschland ist medizinisches Cannabis seit dem 1. März 2017 verschreibungsfähig
(Bild: ©Africa Studio - stock.adobe.com)

Für eine Reihe von Erkrankungen wie Krebs oder Multiple Sklerose gilt Cannabis als vielversprechend, um zumindest Beschwerden zu lindern. Der Einsatz von medizinischem Cannabis ist daher in den letzten Jahren in vielen Ländern legalisiert worden. Hierzulande ist medizinisches Cannabis seit dem 1. März 2017 erstmals verschreibungsfähig. Mit der steigenden Nachfrage rückt auch eine analytische Anforderung zunehmend in den Fokus: die Qualitätskontrolle. So muss u.a. der Gesamtgehalt der Cannabinoide sowie das Verhältnis der einzelnen Cannabinoide zueinander bestimmt werden. Denn: Je nach Gehalt des einzelnen Cannabinoids findet das Produkt eine andere medizinische Anwendung.

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Im Deutschen Arzneibuch 2018 (DAB 2018) veröffentlichte das Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte (BfArM) eine revidierte Monographie „Cannabisblüten“ (Cannabis flos) [1].

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Da das Europäische Arzneibuch (Ph. Eur.) keine entsprechende Monographie enthält, stellt die im Deutschen Arzneibuch 2018 beschriebene Methode zur Gehaltsbestimmung von wirksamen Bestandteilen in Cannabisblüten mittels HPLC die zum jetzigen Zeitpunkt (06/2019) EU-weit verbindliche Methode dar [2]. Die Monographie ist die anerkannte pharmazeutische Regel nach Arzneimittelgesetz und wird bei Entscheidungen der zuständigen Behörden in der EU mit herangezogen.

Die Einteilung des medizinischen Cannabis ist abhängig vom Verhältnis zwischen Cannabidiol (CBD) und Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC) und erfolgt in drei unterschiedliche Produktgruppen (s. Tab. 1). Je nach deren Verhältnis finden diese Produkte unterschiedliche medizinische Anwendung.

Probenvorbereitung

Die Herstellung der Standardlösungen und die Probenaufarbeitung erfolgt mit dem in der Monographie beschriebenen Verfahren: Für die Probenaufarbeitung werden 0,500 g pulverisiertes Cannabis 15 min lang mit 20 ml Ethanol 96% geschüttelt und anschließend zentrifugiert. Der klare Überstand wird in einen 50-ml-Messkolben überführt. Der Rückstand wird zweimal mit je 12,5 ml Ethanol 96% gleichermaßen behandelt. Die organischen Lösungen werden zusammengeführt und mit Ethanol 96% R zu 50,0 ml ergänzt. Diese Lösung wird durch ein Membranfilter aus regenerierter Cellulose von 0,45 µm nominaler Porenweite filtriert. 1,0 ml Filtrat wird mit Ethanol 96% zu 10,0 ml ergänzt [1].

Aus den Standardsubstanzen werden fünf Referenzlösungen der einzelnen Wirkstoffe in Methanol hergestellt. Für die Kalibration werden mindestens sechs Kalibrationslösungen aus den Referenzlösungen erzeugt, wobei jeweils eine definierte Konzentration zwingend gefordert wird.

Prüfung und Kalibration

Für die Eignungsprüfung wird eine weitere Referenzlösung aus Δ9-Tetrahydrocannabinol und Δ8-Tetrahydrocannabinol hergestellt. Die Auflösung zwischen beiden Peaks muss mindestens 1,2 betragen. Die Reproduzierbarkeit der Flächenwerte wird durch eine Sechsfach-Injektion der THCA-Referenzlösung bei RSD <1% belegt. Für die Kalibration werden mindestens sechs Kalibrationspunkte der jeweiligen Substanzen gemessen. Die Auftragung der Peakflächen erfolgt gegen die Konzentration und wird linear gefittet.

Die Auftrennung der zu bestimmenden Komponenten Cannabidiolsäure (CBDA), Cannabidiol (CBD), Cannabinol (CBN), Δ9-Tetrahydro­cannabinol (THC) und Δ9-Tetra­hydrocannabinolsäure (THCA) wird auf einer C18-Umkehrphase durchgeführt.

Analytische Bedingungen der Cannabis-Analytik

Die im praktischen Beispiel angewandten analytischen Bedingungen sind in Tabelle 3 (s. online) zusammengefasst. Die Herstellung der Standardlösungen und die Probenaufarbeitung erfolgen mit dem in der Monographie beschriebenen Verfahren. Die Referenzlösungen und Standards werden dabei in Methanol angesetzt, die Proben in Ethanol. Dies führt zu unterschiedlichen Peakformen bei Standards und Proben. Im Fall der ethanolischen Probenextrakte ist eine verringerte Trennleistung der Säule die Folge (s. Abb. 2). Der Probenextrakt-Peak weist eine Verbreiterung durch eine Schulter am Anfang des Peaks auf. Der Standard hingegen hat einen nahezu gaußförmigen Peak.

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