Detektivarbeit am Detektor

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Das Material aus dem zweiten Peak wurde mittels SEC-MALS analysiert, und dabei kam ans Licht, dass sein Molekulargewicht sicher deutlich niedriger ist als zuvor ohne Lichtstreuung mit konventionellem Standard bestimmt. Mit den ermittelten 60 kDa liegt das Resultat recht nahe an den 46 kDa, die für das Monomer zu erwarten sind. Sie entsprechen außerdem den Befunden aus der Gel-Elektrophorese (s. Abb. 2, grünes Signal).

Wie ist aber nun der etwas höhere Wert von 60 kDa zu erklären? Um dies interpretieren zu können, muss man sich klar machen, dass Moleküle in Lösung normalerweise in einem dynamischen Gleichgewicht vorliegen, niemals in statischer, stets gleichbleibender Verteilung. Unter dieser Voraussetzung ist auch die Annahme plausibel, in der Lösung könnten nicht nur Monomere, sondern auch – in statistischer Verteilung – ein geringer Anteil an Dimeren und Aggregaten höherer Ordnung vorhanden sein, die sich in einem permanenten Fließgleichgewicht befinden. Eine Momentaufnahme dieses Gleichgewichts, wie sie die benutzten Analysetechniken darstellen, könnte also zwangsläufig gar nicht die Daten für eine rein monomere Lösung liefern, sondern müsste einen Mittelwert aus den gerade vorhandenen Spezies widerspiegeln. Da eine hohe Konzentration der Proteine die Bildung von Aggregaten begünstigt und sich damit auf das Verhältnis zwischen Monomeren und Aggregaten auswirkt, sollte sich umgekehrt das daraus resultierende Molekülgewicht verkleinern und damit dem Monomer-Wert annähern, wenn man die Messung mit niedriger konzentrierten Proben durchführt. So weit die Theorie. Die Wiederholung der Messungen mit 20-fach niedrigerer Proteinkonzentration lieferte allerdings exakt die gleichen Daten für das Molekülgewicht (s. Abb. 2, grüne und braune Signale). Die Diskrepanz musste also einen anderen Grund haben.

Eine weitere Chance, zur Lösung des Problems vorzudringen, versprach der Umstand, dass das Protein in eukaryotischen Zellen synthetisiert worden war. Eine Proteinmodifikation durch Glykosylierung ist hier weit verbreitet und die Sequenzanalyse der verwendeten Vektoren ließ eine Reihe möglicher Glykosylierungsstellen im resultierenden Peptid vermuten. Eine Protein-Konjugat-Analyse ergab schließlich tatsächlich die Beteiligung zweier Komponenten, nämlich eines Proteinanteils von etwa 45 kDa und eine Glykosylierungs-Fraktion mit einem Molekülgewicht zwischen 10 und 15 kDa (s. Abb. 4).

Während der nun gemessene Proteinwert der Theorie entsprach, passten auch die Daten für die Kohlehydrat-Komponenten zur Anzahl potenzieller Glykosylierungsstellen im Molekül, wie sie für die Produkte dieser Zelllinie typisch sind.

Des Rätsels Lösung lautete also wie folgt: Unser rekombinantes Protein lag unter den gewählten Versuchsbedingungen als glykosyliertes Monomer vor. Das atypische Elutionsverhalten des Moleküls während des ersten SEC-Laufs beruht vermutlich auf Veränderungen seiner hydrodynamischen Eigenschaften durch die Glykosylierung.

Mit DLS zum kompletten Bild

Parallel zu den Messungen mit MALS wurde auch die DLS in Form des integrierten DLS-Detektors eingesetzt. Während MALS für die Bestimmung des Molekülgewichts zuständig ist, lässt sich mithilfe der DLS gleichzeitig der hydrodynamische Radius der Probe messen. Dieser liegt bei 4 nm (s. Abb. 3, grün).

Damit erscheint das Protein deutlich größer als ein vergleichbares, „typisches“ globuläres, unmodifiziertes Pendant mit gleichem Molekülgewicht. Zum Vergleich: Rinder-Serum-Albumin (BSA) bringt es mit seinen 66 kDa auf einen Radius von lediglich 3,4 nm (s. Abb. 3, violetter Haupt-Peak). Führt man sich das Trennprinzip der SEC vor Augen, nämlich die Separation entsprechend dem hydrodynamischen Radius eines Moleküls, so wird klar: eine Komponente mit größerem Rh wird die Säule früher verlassen als eine kleinere. Dadurch erklärt sich auch das beobachtete Phänomen: Unmodifiziertes BSA mit kleinerem Rh eluiert später, obwohl es ein größeres Molekülgewicht besitzt als das rekombinante Protein. Letzteres erscheint bei der Trennung deshalb früher, weil es trotz niedrigeren Molekülgewichts aufgrund seiner zahlreichen Glykosylierungen insgesamt gewissermaßen „sperriger“ ist. Es besitzt also einen größeren Rh, ihm steht weniger passierbarer Raum in der Säule zur Verfügung, und folglich eluiert es eher als das BSA.

High-End-MALS-Technologie

Das Institut in Cambridge nutzte Lichtstreu-Detektoren auch in einer wegweisenden Studie, die das bisherige wissenschaftliche Verständnis zu viral verursachten Krankheitsbildern wie etwa AIDS oder Norovirus-assoziierten Gastroenteritiden grundlegend veränderte. Diese Erkrankungen sind außerordentlich schwer zu behandeln, insbesondere da sich die auslösenden Viren der Immunerkennung zu entziehen vermögen, indem sie ihren molekularen „Fingerabdruck“ permanent verändern. Sind die Viren erst einmal ins Innere der Zellen eingedrungen, können auch Antikörper kaum noch etwas ausrichten, denn ihre Funktion ist vor allem auf die extrazelluläre Verteidigung ausgelegt. Die Wissenschaftler beschrieben erstmalig einen speziellen dreiteiligen intrazellulären Antikörper-Rezeptor, den Tripartite-Motif-Containing 21 (TRIM 21), der bei der Abwehr solcher viraler Erreger eine wichtige Rolle zu spielen scheint. Dieser befindet sich im Cytosol und erkennt Viruspartikel, an die bereits IgG, also spezifische Antikörper, angekoppelt sind und die ins Zellinnere gelangen. TRIM 21 bindet nun mit extrem hoher Affinität diese Komplexe aus Virus und Immunglobulin. Sodann vermittelt TRIM 21 die Kopplung cytosolischer, zelleigener Enzymkomplexe an die eingedrungenen Strukturen. Die Enzyme greifen daraufhin die Viren an und verdauen deren Bestandteile, bevor die verhängnisvolle Translation viraler Gene durch die gekaperte Zelle beginnen kann. Die Mechanismen dieses Prozesses konnte man auch deshalb bis ins kleinste Detail aufklären, weil dabei Lichtstreugeräte vom Typ Wyatt Dawn Heleos II zum Einsatz kamen.

* C. Johnson: Medical Research Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, Großbritannien

* *S. Kenrick: Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA, USA

* **T. Jocks, D. Roessner: Über-tragung aus dem Englischen und Manuskript-herstellung, Wyatt Technology Europe GmbH, 56307 Dernbach

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