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Analyse der mikrobiologischen Wasserqualität

Durchflusszytometrie – Funktionsprinzip und Anwendungsbeispiele

| Autor / Redakteur: Andreas Nocker* / Marc Platthaus

Trinkwasser muss auf seine mikrobiologische Wasserqualität untersucht werden.
Trinkwasser muss auf seine mikrobiologische Wasserqualität untersucht werden. (Bild: gemeinfrei)

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Die Einführung der ersten kommerziell erhältlichen Online-Durchflusszytometer bedeutete für die allgemeine mikrobiologische Wasserqualitätsbestimmung einen Paradigmenwechsel. Seitdem können Bakterienkonzentrationen in Wasser quasi online überwacht werden, was vor einigen Jahren selbst von Mikrobiologen als unrealistisch angesehen worden wäre.

Die Durchflusszytometrie hat sich in den vergangenen Jahren zu einer leistungsfähigen Methode entwickelt, mit der sich die Gesamt- und Lebendzellzahlen von Bakterien in Wasserproben schnell (rund 15 min) bestimmen lassen. Die Methode entfaltet ihre Stärke, wo Untersuchungen schnell und unabhängig von spezifischen Indikatororganismen durchgeführt werden sollen. Beispiele sind die mikrobiologische Optimierung von Wasser-Aufbereitungsprozessen oder die Untersuchung der mikrobiologischen Wasserqualität während der Verteilung. Standardisierte Protokolle wurden von der EAWAG entwickelt (Hammes et al. 2007a, 2008a) und in Ringversuchen evaluiert. Die aussagekräftigen Resultate waren die Basis für den Einzug in die Schweizer Gesetzgebung, wo die Technologie als Methode 333.1 vom Schweizer Bundesamt für Gesundheit zur Bestimmung der „Totalzellzahl und des quantitativen Verhältnisses der Zellen niedrigen bzw. hohen Nukleinsäuregehaltes in Süßwasser“ (Schweizer Lebensmittelbuch 2012) empfohlen wird.

Auch Wasserversorger in anderen Ländern haben sich in den letzten Jahren der Methode gegenüber sehr offen gezeigt. Dies trifft speziell auf den Bereich Prozessmonitoring zu, wo wirtschaftliche Überlegungen und größtmögliche mikrobiologische Sicherheit in Einklang zu bringen sind.

Fluoreszenzfarbstoffe: Durchbruch für die Durchflusszytometrie

Der Einsatz der Durchflusszytometrie in der Wasser-Mikrobiologie war anfänglich erschwert durch die Winzigkeit der darin enthaltenen Mikroorganismen und kam erst durch den Gebrauch von Fluoreszenzfarbstoffen zum Durchbruch, welche die Mikroorganismen unterscheidbar machen von anderen im Wasser befindlichen Partikeln. Die Mikroorganismen werden dafür nach Färbung durch eine enge Kapillare geschickt, wo sie einzeln von einem Laserstrahl erfasst und damit auszählbar werden.

Durch Verwendung eines oder zweier Farbstoffe erhält man die Konzentration aller Mikroorganismen (Gesamtzellzahl) bzw. die Konzentration der Mikroorganismen mit intakter Zellmembran (Intaktzellzahl). Bei einer vollständigen Membranintegrität wird vorausgesetzt, dass die detektierte Zelle lebt. Neben Zellkonzentrationen erlaubt sie die Unterscheidung von charakteristischen Bakterienpopulationen, die sich im Nukleinsäuregehalt unterscheiden (s. Abb. 1). Bakterien mit hohem Nukleinsäuregehalt (high nucleic acid, HNA) dominieren oft bei hohem Nährstoffangebot und bei Stagnation (Egli und Kötzsch 2013). Bakterien mit geringerem Nukleinsäuregehalt (low nucleic acid, LNA) bevorzugen nährstoffarme Bedingungen.

Wie funktioniert die Durchflusszytometrie? Die Hochschule Coburg erklärt dies anschaulich in einem dreigeteilten Video
Teil 1 (00:05): Grundlagen
Teil 2 (05:07): Messung und Generierung der Ergebnisse
Teil 3 (11:54): Färbung

Wasserqualität auf einem neuen Level analysieren

Die Durchflusszytoemtrie bedingt unvermeidlich, sich an eine neue Dimension von Bakterienzahlen in Wasser anzunähern. Während sich die klassische Wassermikrobiologie auf die Analyse von kultivierbaren fäkalen Indikatorbakterien oder die Gesamtkoloniezahl beschränkt, sind die Gesamtzellzahlen der Durchflusszytometrie in einer Größenordnung, die bisher nur aus der Mikroskopie bekannt war, mit Tausenden von Bakterien pro Milliliter (s. Abb. 2). Vergleichbar dazu sind kulturell eine Vielzahl an Trinkwasserproben befundfrei oder weisen Koloniezahlen unter dem in der Trinkwasserverordnung festgelegten Grenzwert von z.B. 100 koloniebildenden Einheiten pro Milliliter (KBE/mL) auf.

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Durchflusszytometrie zur Qualitätskontrolle von wässrigen Proben

Die Diskrepanz zur Koloniezahl beruht vorwiegend auf der Tatsache, dass sich nur ein kleiner Bruchteil der sich im Wasser befindlichen Bakterien auf Standardnährböden kultivieren lassen. In Trinkwasser wird ihr Anteil auf ca. 0,1 bis 1% geschätzt (Szewzyk et al. 2000; Ultee et al. 2004). Daneben können Bakterien ihre Kultivierbarkeit auch verlieren als Folge von Nährstoffmangel, sublethaler Schädigung bei schwacher Desinfektion (Zhang et al. 2015) oder durch chemische oder physikalische Faktoren (Ashbolt 2015; Ramamurthy et al. 2014; Oliver 2010). Gesamtkoloniezahlen sind bei Auftreten solcher Faktoren tief und wenig hilfreich für die Analyse operativer Prozesse. Durchflusszytometrie ermöglicht hier, den mikrobiologischen Ist-Zustand unabhängig von diesen, den Verlust der Kultivierbarkeit bedingenden Faktoren, zu erfassen.

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