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Analyse der mikrobiologischen Wasserqualität

Durchflusszytometrie – Funktionsprinzip und Anwendungsbeispiele

| Autor / Redakteur: Andreas Nocker* / Marc Platthaus

Trinkwasser muss auf seine mikrobiologische Wasserqualität untersucht werden. Dabei hilft die Durchflusszytometrie.
Trinkwasser muss auf seine mikrobiologische Wasserqualität untersucht werden. Dabei hilft die Durchflusszytometrie. (Bild: gemeinfrei)

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Wie funktioniert die Durchflusszytometrie und wo wird sie angewendet? Erfahren Sie in diesem Beitrag, wie Durchflusszytometer für die allgemeine mikrobiologische Wasserqualitätsbestimmung eingesetzt werden und welche Vorteile sie bieten.

Die Durchflusszytometrie hat sich in den vergangenen Jahren zu einer leistungsfähigen Methode entwickelt, mit der sich die Gesamt- und Lebendzellzahlen von Bakterien in Wasserproben schnell (rund 15 min) bestimmen lassen. Die Methode entfaltet ihre Stärke, wo Untersuchungen schnell und unabhängig von spezifischen Indikatororganismen durchgeführt werden sollen.

Beispiele sind die mikrobiologische Optimierung von Wasser-Aufbereitungsprozessen oder die Untersuchung der mikrobiologischen Wasserqualität während der Verteilung. Standardisierte Protokolle wurden von der EAWAG entwickelt (Hammes et al. 2007a, 2008a) und in Ringversuchen evaluiert. Die aussagekräftigen Resultate waren die Basis für den Einzug in die Schweizer Gesetzgebung, wo die Technologie als Methode 333.1 vom Schweizer Bundesamt für Gesundheit zur Bestimmung der „Totalzellzahl und des quantitativen Verhältnisses der Zellen niedrigen bzw. hohen Nukleinsäuregehaltes in Süßwasser“ (Schweizer Lebensmittelbuch 2012) empfohlen wird.

Wie die Durchflusszytometrie Zellzählung in unter zwei Sunden ermöglicht, erfahren Sie in dem Whitepaper Durchflusszytometrischer Ansatz für probiotische Zellzählung.

Auch Wasserversorger in anderen Ländern haben sich in den letzten Jahren der Methode gegenüber sehr offen gezeigt. Dies trifft speziell auf den Bereich Prozessmonitoring zu, wo wirtschaftliche Überlegungen und größtmögliche mikrobiologische Sicherheit in Einklang zu bringen sind.

Fluoreszenzfarbstoffe: Durchbruch für die Durchflusszytometrie

Der Einsatz der Durchflusszytometrie in der Wasser-Mikrobiologie war anfänglich erschwert durch die Winzigkeit der darin enthaltenen Mikroorganismen und kam erst durch den Gebrauch von Fluoreszenzfarbstoffen zum Durchbruch, welche die Mikroorganismen unterscheidbar machen von anderen im Wasser befindlichen Partikeln. Die Mikroorganismen werden dafür nach Färbung durch eine enge Kapillare geschickt, wo sie einzeln von einem Laserstrahl erfasst und damit auszählbar werden.

Abb. 1: Durchflusszytometrie-Signale werden meist in einem 2D-Diagramm visualisiert, bei dem jedem Signal spezifische Fluoreszenzwerte zugeordnet werden. Das schematische Beispiel zeigt intakte/lebende Bakterien im rot umrahmten Feld und tote Zellen außerhalb davon. Bei den intakten Zellen sind typischerweise Zellen mit hohem (HNA) und niedrigem (LNA) Nukleinsäuregehalt unterscheidbar. Erstere finden sich vermehrt in stagnierendem Wasser und bei hohem Nährstoffangebot.
Abb. 1: Durchflusszytometrie-Signale werden meist in einem 2D-Diagramm visualisiert, bei dem jedem Signal spezifische Fluoreszenzwerte zugeordnet werden. Das schematische Beispiel zeigt intakte/lebende Bakterien im rot umrahmten Feld und tote Zellen außerhalb davon. Bei den intakten Zellen sind typischerweise Zellen mit hohem (HNA) und niedrigem (LNA) Nukleinsäuregehalt unterscheidbar. Erstere finden sich vermehrt in stagnierendem Wasser und bei hohem Nährstoffangebot. (Bild: Nocker/IWW)

Durch Verwendung eines oder zweier Farbstoffe erhält man die Konzentration aller Mikroorganismen (Gesamtzellzahl) bzw. die Konzentration der Mikroorganismen mit intakter Zellmembran (Intaktzellzahl). Bei einer vollständigen Membranintegrität wird vorausgesetzt, dass die detektierte Zelle lebt. Neben Zellkonzentrationen erlaubt sie die Unterscheidung von charakteristischen Bakterienpopulationen, die sich im Nukleinsäuregehalt unterscheiden (s. Abb. 1). Bakterien mit hohem Nukleinsäuregehalt (high nucleic acid, HNA) dominieren oft bei hohem Nährstoffangebot und bei Stagnation (Egli und Kötzsch 2013). Bakterien mit geringerem Nukleinsäuregehalt (low nucleic acid, LNA) bevorzugen nährstoffarme Bedingungen.

Wasserqualität auf einem neuen Level analysieren

Abb. 2: Gesamtzellzahlkonzentrationsbereiche für verschiedene Wassertypen, wie sie typischerweise mit Durchflusszytometrie detektiert werden. Modifiziert in Anlehnung an Egli und Hammes, 2010. Gas Wasser Abwasser.
Abb. 2: Gesamtzellzahlkonzentrationsbereiche für verschiedene Wassertypen, wie sie typischerweise mit Durchflusszytometrie detektiert werden. Modifiziert in Anlehnung an Egli und Hammes, 2010. Gas Wasser Abwasser. (Bild: IWW)

Die Durchflusszytoemtrie bedingt unvermeidlich, sich an eine neue Dimension von Bakterienzahlen in Wasser anzunähern. Während sich die klassische Wassermikrobiologie auf die Analyse von kultivierbaren fäkalen Indikatorbakterien oder die Gesamtkoloniezahl beschränkt, sind die Gesamtzellzahlen der Durchflusszytometrie in einer Größenordnung, die bisher nur aus der Mikroskopie bekannt war, mit Tausenden von Bakterien pro Milliliter (s. Abb. 2). Vergleichbar dazu sind kulturell eine Vielzahl an Trinkwasserproben befundfrei oder weisen Koloniezahlen unter dem in der Trinkwasserverordnung festgelegten Grenzwert von z.B. 100 koloniebildenden Einheiten pro Milliliter (KBE/mL) auf.

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Durchflusszytometrie zur Qualitätskontrolle von wässrigen Proben

Die Diskrepanz zur Koloniezahl beruht vorwiegend auf der Tatsache, dass sich nur ein kleiner Bruchteil der sich im Wasser befindlichen Bakterien auf Standardnährböden kultivieren lassen. In Trinkwasser wird ihr Anteil auf ca. 0,1 bis 1% geschätzt (Szewzyk et al. 2000; Ultee et al. 2004). Daneben können Bakterien ihre Kultivierbarkeit auch verlieren als Folge von Nährstoffmangel, sublethaler Schädigung bei schwacher Desinfektion (Zhang et al. 2015) oder durch chemische oder physikalische Faktoren (Ashbolt 2015; Ramamurthy et al. 2014; Oliver 2010). Gesamtkoloniezahlen sind bei Auftreten solcher Faktoren tief und wenig hilfreich für die Analyse operativer Prozesse. Durchflusszytometrie ermöglicht hier, den mikrobiologischen Ist-Zustand unabhängig von diesen, den Verlust der Kultivierbarkeit bedingenden Faktoren, zu erfassen.

Wie funktioniert die Durchflusszytometrie? Die Hochschule Coburg erklärt dies anschaulich in einem dreigeteilten Video
Teil 1 (00:05): Grundlagen
Teil 2 (05:07): Messung und Generierung der Ergebnisse
Teil 3 (11:54): Färbung

Anwendungen der Durchflusszytometrie

Die Einsatzmöglichkeiten der Durchflusszytometrie sind vielseitig:

  • Untersuchung der Veränderung der Wasserqualität: Durchflusszytometrie eignet sich hervorragend zum mikrobiologischen Vergleich verschiedener Leitungsstränge in Gebäuden und zur Identifizierung von stagnierendem Wasser. Ein Beispiel für die Veränderung der mikrobiologischen Wasserqualität von Leitungswasser innerhalb eines Gebäudes ist in Abbildung 3 dargestellt.
  • Mikrobiologische Kartierung von Verteilungsnetzen: Was auf Gebäude zutrifft, ist auch übertragbar auf große städtische Wasserverteilungsnetze. Problembereiche mit höheren Bakterienkonzentrationen aufgrund von z.B. Leitungsschäden oder Aufkeimung können so identifiziert werden.
  • Desinfektionseffizienz: Die Abnahme intakter lebender Zellen infolge chemischer Desinfektion kann mittels Durchflusszytometrie quantitativ abgebildet werden (Gillespie et al. 2014). Ein Beispiel der Wirkung von Chlor auf Bakterien im Wasser ist in Abbildung 4 gezeigt.
  • Effizienz mehrstufiger Aufbereitungsprozesse: Die Änderung der Bakterienkonzentration durch die einzelnen Stufen eines Aufbereitungsprozesses gibt Aufschluss über die Behandlungseffizienz und ermöglicht prozesstechnische Optimierung (Hammes et al. 2008b; Helmi et al. 2014). Ein Anwendungsbeispiel ist die Messung des Rückhaltevermögens von Mikroorganismen bei der Ultrafiltration.
  • Überwachung von Rohwasserqualität: Sowohl die Gesamtzellzahl als auch die Verteilung der beiden Cluster HNA und LNA ermöglichen Aussagen über die Rohwasserqualität (Harry et al. 2016). Nährstoffeintrag bedingt typischerweise eine Verschiebung der Signale in das HNA-Cluster.
  • Aufkeimungspotenzial: Die quantitative Erfassung der Bakterienkonzentration mittels Durchflusszytometrie zu mehreren Zeitpunkten erlaubt einen Rückschluss auf das Aufkeimungspotenzial in der betrachteten Zeitperiode und kann eine Alternative zur AOC-Bestimmung sein (Hammes et al. 2007b). Eine Erhöhung der Zellzahlen zwischen zwei zeitlich getrennten Messpunkten korreliert mit dem im Wasser enthaltenen Nährstoffangebot.

Hygienische Bedeutung

Bestimmung der Gesamtbakterien- und Intaktzellzahl durch Durchflusszytometrie ist nicht in Konkurrenz mit der Bestimmung von mikrobiologischen Parametern z.B. nach der Trinkwasserverordnung. Da die Durchflusszytometrie bei der Analyse von Wasserproben keine Aussagen trifft über die Art der detektierten Mikroorganismen, ist keine hygienische Aussage hinsichtlich Gesundheitsgefährdung möglich. Jedoch eignet sich Durchflusszytometrie hervorragend zur Kontrolle der Prozesshygiene. Probleme werden reflektiert in einem Abweichen der für das aufbereitete Wasser typischen Zellkonzentration.

Forscher am Fraunhofer ICT-IMM haben ein Durchflusszytometrie-System für die Analyse von Tumorzellen optimiert. Wie sich dieses System von klassischen Geräten unterscheidet, erfahren Sie in unserem LP-exklusiven Interview: „Durchflusszytometrie leicht gemacht“ mit Dr. Michael Baßler, Gruppenleiter Biophysikalische Analytik am Fraunhofer ICT-IMM.

Ausblick

Durchflusszytometrische Analyse beruht traditionell auf Wasserproben, die ins Labor geliefert werden. Obwohl solche Einzelproben Aussagen zur Zellkonzentrationen unter den jeweiligen Bedingungen ermöglichen, stellen diese Momentaufnahmen nur den jeweiligen Ist-Zustand dar und sind oft wenig repräsentativ für lange Zeiträume. Im Forschungsumfeld zeichnete sich in den letzten beiden Jahren eine grundlegende Revolution dieser Vorgehensweise ab. Erste Online-Anwendungen mit Protoypen erlaubten zum ersten Mal die kontinuierliche Messung von Zellkonzentrationen in technischen Systemen sowie in natürlichen Gewässern (Besmer et al. 2014). Online-Systeme, die bei Wasserversorgern aufgestellt werden können, erlauben die Entfaltung des vollen Potenzials der Methode und sind in diesem Jahr zum ersten Mal kommerziell erhältlich. Die mit deren Einsatz einhergehende Datenauflösung verspricht tiefgründige Einsichten in Prozessvariabilität und deren Optimierung.

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