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Gangliosid-Code massenspektrometrisch entschlüsselt „Fatty-sweet Symphony“ der Stammzellen

Von Katharina Hohenwallner Doktorandin Rampler Lab und PD Dr. Evelyn Rampler Gruppenleitung Rampler Lab, Institut für Analytische Chemie, Universität Wien

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Mehrere Verbindungen aus der Gruppe der Glykolipide erweisen sich als potentielle Markerkandidaten für die Stammzell-Differenzierung. Eine Studie basierend auf Massen- spektrometrie decodiert erstmals automatisiert Gangliosidmuster auf struktureller Ebene.

Abb. 1: Proben im Autosampler: Die Massenspektrometrie ermöglicht einen hohen Automatisierungsgrad.
Abb. 1: Proben im Autosampler: Die Massenspektrometrie ermöglicht einen hohen Automatisierungsgrad.
(Bild: © Katharina Hohenwallner)

Zell-basierte Therapien haben sich in der regenerativen Medizin als vielversprechende Behandlungsstrategie für einige vaskuläre, neurologische, Autoimmun-, sowie Skeletterkrankungen erwiesen. Im Fokus der Forschung stehen dabei v. a. mesenchymale Stammzellen (MSCs), da sie u. a. aus verschiedensten Geweben isoliert werden können, hohe in-vitro Proliferations- und Differenzierungskapazitäten aufweisen und zudem durch die Sekretion biologisch aktiver Komponenten immunmodulatorische Wirkungen auf das angeborene und adaptive Immunsystem haben [1]. Der medizinisch wichtige Aspekt der hohen Differenzierungskapazität ermöglicht den MSCs sich in beispielsweise Knorpel-, Knochen-, oder Fettzellen (auch Chondrozyten, Osteozyten und Adipozyten genannt) zu differenzieren. Gleichzeit birgt er die analytische Herausforderung die differenzierten Zelllinien voneinander zu unterscheiden.

Auf der Suche nach möglichen Differenzierungsmarkern ist in den letzten Jahren die Klasse der Glykosphingolipide, insbesondere die Unterkategorie der Ganglioside, in den Fokus der Forschung gerückt [2, 3]. Ganglioside setzen sich aus einer zuckerhaltigen Glykan-, und einer fetthaltigen Ceramidgruppe zusammen und enthalten mindestens eine negativ geladene Sialinsäure. Durch ihre Lokalisation in der Zellmembran sind sie in verschiedenste Zellerkennungs- und Signalmechanismen involviert und können durch die nach außen gerichtete Zuckerkette biochemisch bzw. immunologisch, beispielsweise mit Antikörpern, markiert werden.

Diese Methoden erlauben zwar die Erkennung einiger Gangliosid-Klassen, sind meist jedoch wenig spezifisch und scheitern insbesondere an mechanistisch relevanten strukturellen Details. Die Analyse von Gangliosiden stellt sich durch ihren amphiphilen Charakter, die enorme strukturelle Vielfalt, sowie ihren hohen dynamischen Bereich als extrem herausfordernd dar. Zusätzlich gibt es bisher kaum kommerziell erhältliche Standards, Einträge in Datenbanken sind stark limitiert und eine verlässliche automatisierte Softwarelösung suchte man bisher vergeblich.

Hochauflösende Massenspektrometrie

Mittels der Massenspektrometrie können die Molekülmassen von Ionen, genauer gesagt ihr Masse-zu-Ladungsverhältnis, bestimmt werden. Massenspektrometer bestehen aus einer Ionenquelle, in der es zur Ionisierung der Analyten durch Anlegen einer positiven (Positivmodus) bzw. negativen (Negativmodus) Spannung kommt, einem Massenanalysator, sowie einem Detektor. Neben qualitativen und quantitativen Analysen kann durch Fragmentierungsspektren auch Strukturaufklärung betrieben werden. Massenspektrometer zeichnen sich durch ihren vielfältigen Einsatzbereich und ihre hohe Sensitivität aus und werden für viele Routineanalysen, aber auch zur Aufklärung verschiedenster Forschungsfragen eingesetzt.

MS-Methoden für das Gangliosid-Profiling

In der Protein- und Lipidanalytik hat sich die Massenspektrometrie (MS) als Analysemethode der Wahl etabliert. Deren hohe Sensitivität ermöglicht qualitative und quantitative Analytik selbst in sehr niedrigen Konzentrationsbereichen. Zudem können wichtige strukturelle Informationen von chemischen Verbindungen gewonnen werden. Durch die Kopplung mit Flüssigchromatographie (engl. liquid chromatography, LC) lassen sich die Analyten vorab auftrennen. Dadurch erhält man zusätzlich zum Masse-Ladungsverhältnis (m/z) spezifische Retentionszeit-Informationen, welche zur Identifizierung genutzt werden können.

In einer gemeinsamen Studie der Universität Wien, BOKU Wien und Uni Graz wurde eine Analysemethode entwickelt, die ein umfassendes Gangliosid-Profiling erlaubt und erstmals auch eine frei-zugängliche Software zur automatisierten Datenauswertung zur Verfügung stellt [4]. Die Methode beruht auf der Trennung der Ganglioside mit Umkehrphasen-Flüssigchromatographie (engl. reversed phase liquid chromatography, RP-LC) gekoppelt mit einem hochauflösenden Massenspektrometer, der mehrstufige Fragmentierung, und dadurch die Generierung spezifischer Fragmentierungsspektren, ermöglicht.

Abb. 2: Profiling-Methode: Isolierung und Differenzierung der MSCs mit anschließender Extraktion und LC-MS Analyse und Datenauswertung 
(LC = liquid chromatography, HRMS = high resolution mass spectrometry).
Abb. 2: Profiling-Methode: Isolierung und Differenzierung der MSCs mit anschließender Extraktion und LC-MS Analyse und Datenauswertung 
(LC = liquid chromatography, HRMS = high resolution mass spectrometry).
(Bild: Universität Wien)

Abbildung 2 zeigt den Ablauf der entwickelten Gangliosid-Methode. Zuerst werden MSCs von einem hu­manen Donor (medizinischer Abfall bei Operationen) isoliert und mittels Zellkultur zur Differenzierung in Osteozyten, Chondrozyten und Adipozyten gebracht. Anschließend erfolgt eine Methyl-tert-butylether (MTBE) basierte Extraktion, die Lipidfraktion enthält dabei die Ganglioside. Mittels RP-LC werden die Ganglioside aufgetrennt und anschließend im Massenspektrometer detektiert. Das verwendete Massenspektro­meter hat dabei zwei verschiedene Massenanalysatoren, die parallele Fragmentierungen ermöglichen: Während in der Orbitrap die intakten Moleküle (MS1) gemessen und zur Fragmentierung (MS2) gebracht werden, kann gleichzeitig in der Ionenfalle ein weiteres Mal fragmentiert werden (MS3). Die Möglichkeit der Generierung von MS3-Spektren erlaubt es, durch die noch spezifischeren Fragmente, verlässliche Strukturaussagen zu tätigen. Die Daten werden abschließend in der Auswertesoftware Lipid Data Analyzer (LDA) analysiert und die Ganglioside mithilfe der spezifischen Fragmentmuster identifiziert.

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Abb. 3: Annotierungs-Beispiel: MS2-Spektrum einer Adipozyten-Probe mit zugeordneten Fragmenten, die eine eindeutige Identifizierung der Gangliosidspezies zulassen. (NeuAc = Sialinsäure, Hex = Glucose oder Galactose, können mit MS nicht unterschieden werden, LCB = long chain base, FA = fatty acid).
Abb. 3: Annotierungs-Beispiel: MS2-Spektrum einer Adipozyten-Probe mit zugeordneten Fragmenten, die eine eindeutige Identifizierung der Gangliosidspezies zulassen. (NeuAc = Sialinsäure, Hex = Glucose oder Galactose, können mit MS nicht unterschieden werden, LCB = long chain base, FA = fatty acid).
(Bild: Universiät Wien; Adaptiert aus Hohenwallner et al., 2022 [4])

Wie genau die Annotierung der Fragmente erfolgt, ist beispielhaft in Abbildung 3 gezeigt. Der LDA wurde um Gangliosid-spezifische Regeln, den „decision rules“, die durch die Messung von Standards entwickelt wurden, erweitert. In der dargestellten Struktur lassen sich die möglichen Bruchstellen (graue Pfeile) bei der Fragmentierung erkennen. Es können somit einerseits das intakte Molekül (siehe auch symbolische Darstellung), andererseits auch die, je nach Bruchstelle, entstehenden Fragmente gesucht werden. Der LDA berechnet dabei alle theoretisch möglichen Zusammensetzungen des Glykan- und Lipidteils.

Die Sialinsäure (pinke Raute) ist ein für Ganglioside sehr spezifisches Zuckermolekül, welches für eine eindeutige Identifizierung gefunden werden muss. In diesem Beispiel konnte zudem der Ceramid­part vollständig entschlüsselt werden, da sowohl für die so genannte „long chain base“ (LCB), als auch für die Fettsäure ( engl. fatty acid, FA), die jeweiligen Fragmente annotiert werden konnten. Während im dargestellten Positivmodus v. a. die Ceramidgruppe decodiert wird, finden sich im Negativmodus (nicht gezeigt) Informationen über die Zusammensetzung der Glykangruppe. Die Kombination beider Polaritäten bringt daher den detailliertesten Informationsgrad.

Ganglioside als Differenzierungsmarker?

Abb. 4: Querschnitt eines Quadrupols (Bauteil im Massenspektrometer)
Abb. 4: Querschnitt eines Quadrupols (Bauteil im Massenspektrometer)
(Bild: © Katharina Hohenwallner)

Die Methode ermöglichte die Detektion der bisher meisten Gangliosid-Spezies und erlaubte auf struktureller Ebene erstmals die Struktur des Lipidparts automatisiert zu entschlüsseln. Im Rahmen der Studie wurde gezeigt, dass sich die vorhandenen Gangliosidmuster in den verschiedenen Zelltypen unterscheiden. Ganglioside haben damit großes Potential als Differenzierungsmarker eingesetzt werden zu können. In einer unabhängigen Folgestudie mit größeren Stichproben soll dies nun bestätigt werden.

„It´s glycolipid-time“

Glykoforschung steht nicht zuletzt aufgrund der erst kürzlichen Vergabe des Nobelpreises für Chemie an Carolyn Bertozzi – für ihre wegweisende bioorthogonale Markierungsstrategie von Glykanen – im Fokus der Öffentlichkeit. Die generelle Nachfrage nach Analysestrategien, insbesondere im kombinatorischen Spannungsfeld zwischen Glykan- und Lipidanalytik ist daher hoch.

Abb. 5: MTBE basierte Zweiphasen-Extraktion der Stammzell-Proben
Abb. 5: MTBE basierte Zweiphasen-Extraktion der Stammzell-Proben
(Bild: © Katharina Hohenwallner)

Die im Open Access „Journal of the American Chemical Society Au“ vorgestellte Massenspetrometrie- basierte Gangliosid-Methode [4] wurde erst kürzlich mit Preisen auf zwei internationalen Konferenzen aus­gezeichnet. Aktuell wird die Gangliosid-spezifische Methode für weitere Glykolipid-Klassen erweitert und soll zukünftig auch für weitere medizinisch relevante Fragestellungen angewendet werden. Gangliosiden wird beispielsweise in Krebszellen eine bedeutende Rolle zugeschrieben [5]. Der präsentierte Workflow könnte zukünftig tiefere Einblicke in die zugrunde liegenden Mechanismen ermöglichen. Darüber hinaus wäre auch die Kombination mit anderen Methoden, wie der bioorthogonalen Markierung, denkbar, um die Glykolipid-Strukturen auf Zelloberflächen und den Einfluss auf ihre Umgebung eingehender untersuchen zu können.

Literatur:

[1] Nikolits, I., Nebel, S., Egger, D., Kreß, S. & Kasper, C. Towards Physiologic Culture Approaches to Improve Standard Culti­vation of Mesenchymal Stem Cells. Cells 10, (2021).

[2] Bergante, S. et al. Gangliosides as a potential new class of stem cell markers: The case of GD1a in human bone marrow mesenchymal stem cells. J Lipid Res 55, 549–560 (2014).

[3] Moussavou, G. et al. Role of gangliosides in the differentiation of human mesenchymal-derived stem cells into osteoblasts and neuronal cells. BMB Rep 46, 527 (2013).

[4] Hohenwallner, K. et al. Decoding Distinct Ganglioside Patterns of Native and Differentiated Mesenchymal Stem Cells by a Novel Glycolipidomics Profiling Strategy. JACS Au (2022) doi:10.1021/jacsau.2c00230.

[5] Sasaki, N., Toyoda, M. & Ishiwata, T. Gangliosides as signaling regulators in cancer. Int J Mol Sci 22, (2021).

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