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FRET-Mikroskopie

FRET-Mikroskopie spürt Botenstoffe in Bakterien auf

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Abbildung 1 zeigt eine Aufnahme von sich teilenden Zellen des Krankeitserregers Pseudomonas aeruginosa, der in der Lunge zu Biofilmbildung und schweren Infektionen führen kann. Die FRET-Mikroskopie macht Signalvorgänge in einzelnen Zellen sichtbar und vermittelt den Forschern ein Bild von der heterogenen Botenstoffverteilung innerhalb einer Zellkultur. Werden, wie in Abbildung 3 gezeigt, sich teilende Zellen über einen längeren Zeitraum unter dem Mikroskop beobachtet, können Botenstoffveränderungen innerhalb von Zellen verfolgt werden. Aufgrund von solchen Aufnahmen gelang es, zu zeigen, dass der bakterielle Botenstoff c-di-GMP während der Zellteilung asymmetrisch auf die beiden Tochterzellen verteilt wird. Jeweils eine Tochterzelle (rot) weist c-di-GMP-Konzentrationen von unter 100 nM auf und entwickelt sich dadurch zu einer schwimmenden virulenten Zelle. Die andere Tochterzelle (grün) hat eine fünfmal höhere Botenstoffkonzentration und entwickelt einen sesshaften, biofilmbildenden Zelltyp aus. Solche zellspezifischen Unterschiede in Botenstoffverteilungen konnten bisher in Bakterien nicht beobachtet werden. Dies zeigt eindrücklich das Potenzial der FRET-Mikroskopie zum Studium von bakteriellen Signalkaskaden auf. Damit können mit dieser Technik Konzentrationsunterschiede von 1 bis 2 Signalmolekülen pro Pixel Auflösung gemessen werden. Limitiert wird die derzeitige Nachweisgrenze einzig durch die Belichtungszeit der EM-CCD-Kamera von 100 bis 200 Millisekunden und damit vom Diffusionsweg der Biosensoren und Signalmoleküle innerhalb der beobachteten Zellen.

Hochdurchsatz-Screening

Nicht nur in der Mikroskopie sondern auch für Hochdurchsatz-Screenings lassen sich FRET-Biosensoren einsetzen. Die Wirkstoffsuche fordert robuste Analysemethoden mit hohem Probendurchsatz für das biochemische Wirkstoff-Screening. Unter Verwendung von Fluoreszenz-Spektrometern können Signalstoffe innerhalb komplexer Proben (in Zellkulturen oder Zellextrakten) im Millisekunden-Bereich detektiert werden. Von Vorteil ist hier, wenn der Fluoreszenz-Reader mit dichroitischen Spiegeln und zwei parallelen Photomulti-pliern (PMT’s) ausgestattet ist. Dann können die beiden Fluoreszenzkanäle (CFP und FRET) simultan gemessen werden, was kleinere Messfehler und schnellere Messungen erlaubt. Im Gegensatz zu Nachweisverfahren wie ELISA oder Bead-basierten Assays (z.B. Alphascreen von Perkin Elmer), misst der FRET-Biosensor keine Probenmengen, sondern freie Konzentrationen an Signalstoffen. Bleaching-Effekte, wie sie z.B. bei der Alpha-Screening-Technologie vorkommen, sind vernachlässigbar. Dadurch werden neben Endpunkt-Messungen auch kinetische Messungen im Multi-Well-Format möglich.

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