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FRET-Mikroskopie

FRET-Mikroskopie spürt Botenstoffe in Bakterien auf

27.12.2010 | Autor / Redakteur: Matthias Christen* / Marc Platthaus

Abb. 1: Dank eines neuen Biosensors, welcher die Konzentration des Botenstoffes c-di-GMP misst, erscheinen die virulenten Keime (rot) einer Pseudomonas-Kultur in einem anderen Licht als persistente Keime (grün).
Abb. 1: Dank eines neuen Biosensors, welcher die Konzentration des Botenstoffes c-di-GMP misst, erscheinen die virulenten Keime (rot) einer Pseudomonas-Kultur in einem anderen Licht als persistente Keime (grün).

In Forschung und Drug Discovery gewinnen bioanalytische Nachweismethoden für zelluläre Signalstoffe immer mehr an Bedeutung. Lesen Sie, wie die FRET-Mikroskopie mit neu entwickelten Biosensoren bakterielle Botenstoffe in einzelnen Zellen aufspüren und Konzentrationsunterschiede von wenigen Hundert Molekülen pro Zelle messen kann.

In den letzten Jahren etablierte sich die Methode der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Mikroskopie (FRET) als ein potentes bioanalytisches Nachweisverfahren zur Aufklärung und Beobachtung von Signalprozessen in lebenden Zellen. Genetisch kodierte FRET-Biosensoren haben das Verständnis von zellulären Signalübertragungen in eukaryotischen Zellen revolutioniert und bewiesen, dass sekundäre Botenstoffe zeitlich und örtlich innerhalb von Zellbereichen fluktuieren. Allerdings haben FRET-basierte Nachweisverfahren den Sprung zu den Bakterien bisher nicht geschafft. Das hat unter anderem damit zu tun, dass eine bakterielle Zelle mit einem Durchmesser von 1 bis 2 Mikrometer unter dem Mikroskop ein vielfach schwächeres Fluoreszenzsignal generiert als eine tierische Zelle. Um Botenstoffe in einzelnen Bakterien im nanomolaren Konzentrationsbereich nachzuweisen, muss die FRET-Bioanalytik Unterschiede von 100 bis 200 Signalmolekülen pro Zelle auflösen können.

DNA-codierte Biosensoren

Neu entwickelte Biosensoren für das zyklische di-GMP (c-di-GMP, s. Hintergrundkasten), ermöglichen nun FRET-mikroskopische Beobachtungen von bakteriellen Botenstoffen. Damit lassen sich Entscheidungsprozesse, welche in einzelnen lebenden Bakterien ablaufen, über einen langen Zeitraum unter dem Mikroskop beobachten. Abbildung 2 zeigt schematisch das Prinzip des FRET-Biosensors und illustriert, wie die Bindung des Botenstoffes c-di-GMP an eine interne Rezeptor-Domäne eine Veränderung der FRET-Effizienz zwischen den beiden cyan und gelb fluoreszierenden Proteinen (CFP und YFP) induziert. In Abwesenheit des Botenstoffes sind die beiden Fluoreszenz-Untereinheiten nahe beieinander und FRET ist maximal. Die Bindung von c-di-GMP induziert eine konformationelle Änderung im Biosensor, welche die CFP- und YFP-Domänen voneinander entfernt und folglich die FRET-Effizienz verringert. Dadurch lassen sich molekulare Bindungszustände direkt mittels Messung der Fluoreszenz-Spektren bestimmen. Im Fluoreszenz-Spektrum in Abbildung 2 sind die Veränderungen unter Verwendung von 50 nM Biosensor und zunehmender Botenstoffkonzentration ersichtlich. Wird das Verhältnis der Emissions-Maxima der beiden Fluorophore (527 nm und 485 nm) gegen die Konzentration an Botenstoff aufgetragen, erhält man eine Bindungskurve, welche zur Kalibrierung der FRET-mikroskopischen Messungen herangezogen werden kann. Dazu wird der genetisch kodierte Biosensor in Bakterien exprimiert und FRET-ratiometrisch in den Fluoreszenz-Kanälen bestimmt.

 

Was ist c-di-GMP?

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