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FRET-Mikroskopie FRET-Mikroskopie spürt Botenstoffe in Bakterien auf

Autor / Redakteur: Matthias Christen* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

In Forschung und Drug Discovery gewinnen bioanalytische Nachweismethoden für zelluläre Signalstoffe immer mehr an Bedeutung. Lesen Sie, wie die FRET-Mikroskopie mit neu entwickelten Biosensoren bakterielle Botenstoffe in einzelnen Zellen aufspüren und Konzentrationsunterschiede von wenigen Hundert Molekülen pro Zelle messen kann.

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In den letzten Jahren etablierte sich die Methode der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Mikroskopie (FRET) als ein potentes bioanalytisches Nachweisverfahren zur Aufklärung und Beobachtung von Signalprozessen in lebenden Zellen. Genetisch kodierte FRET-Biosensoren haben das Verständnis von zellulären Signalübertragungen in eukaryotischen Zellen revolutioniert und bewiesen, dass sekundäre Botenstoffe zeitlich und örtlich innerhalb von Zellbereichen fluktuieren. Allerdings haben FRET-basierte Nachweisverfahren den Sprung zu den Bakterien bisher nicht geschafft. Das hat unter anderem damit zu tun, dass eine bakterielle Zelle mit einem Durchmesser von 1 bis 2 Mikrometer unter dem Mikroskop ein vielfach schwächeres Fluoreszenzsignal generiert als eine tierische Zelle. Um Botenstoffe in einzelnen Bakterien im nanomolaren Konzentrationsbereich nachzuweisen, muss die FRET-Bioanalytik Unterschiede von 100 bis 200 Signalmolekülen pro Zelle auflösen können.

DNA-codierte Biosensoren

Neu entwickelte Biosensoren für das zyklische di-GMP (c-di-GMP, s. Hintergrundkasten), ermöglichen nun FRET-mikroskopische Beobachtungen von bakteriellen Botenstoffen. Damit lassen sich Entscheidungsprozesse, welche in einzelnen lebenden Bakterien ablaufen, über einen langen Zeitraum unter dem Mikroskop beobachten. Abbildung 2 zeigt schematisch das Prinzip des FRET-Biosensors und illustriert, wie die Bindung des Botenstoffes c-di-GMP an eine interne Rezeptor-Domäne eine Veränderung der FRET-Effizienz zwischen den beiden cyan und gelb fluoreszierenden Proteinen (CFP und YFP) induziert. In Abwesenheit des Botenstoffes sind die beiden Fluoreszenz-Untereinheiten nahe beieinander und FRET ist maximal. Die Bindung von c-di-GMP induziert eine konformationelle Änderung im Biosensor, welche die CFP- und YFP-Domänen voneinander entfernt und folglich die FRET-Effizienz verringert. Dadurch lassen sich molekulare Bindungszustände direkt mittels Messung der Fluoreszenz-Spektren bestimmen. Im Fluoreszenz-Spektrum in Abbildung 2 sind die Veränderungen unter Verwendung von 50 nM Biosensor und zunehmender Botenstoffkonzentration ersichtlich. Wird das Verhältnis der Emissions-Maxima der beiden Fluorophore (527 nm und 485 nm) gegen die Konzentration an Botenstoff aufgetragen, erhält man eine Bindungskurve, welche zur Kalibrierung der FRET-mikroskopischen Messungen herangezogen werden kann. Dazu wird der genetisch kodierte Biosensor in Bakterien exprimiert und FRET-ratiometrisch in den Fluoreszenz-Kanälen bestimmt.

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