Wie die Flüssigchromatographie präparativ genutzt wird HPLC in der Praxis

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Die Flüssigchromatographie ermöglicht die Auftrennung komplexer Gemische in ihre Einzelsubstanzen. Doch je ähnlicher sich die Stoffe sind, desto schwieriger sind sie zu trennen. Wie dennoch eine zuverlässige Fraktionierung gelingt, zeigt der folgende Beitrag anhand von zwei Anwenderbeispielen.

In vielen Bereichen der Chemie geht es darum, reine Substanzen aus Stoffgemischen zu gewinnen und weiterzuverwenden, z.B. in Wirkstoffsynthesen. Manchmal soll auch die Reinsubstanz selbst in hochreiner Form vorliegen. Um an die Einzelstoffe heranzukommen, eignet sich die präparative HPLC als Trennmethode. Dabei wird ein Substanzgemisch, entweder als Flüssigkeit oder Feststoff, in einer geeigneten Trägerflüssigkeit gelöst, um es in die HPLC-Säule einzubringen. Meist erfolgt die Probenaufgabe über ein (halb)automatisiertes Injektionssystem oder aber per manueller Einspritzung durch ein Septum.

Wenn der Prozess optimal ausgelegt ist, lassen sich auf der HPLC-Säule einzelne Substanzen in reiner Form von der Mischung abtrennen. Im Chromatogramm sind diese Substanzen als Peaks zu erkennen, idealerweise in Form einer Gaußkurve. In realen Experimenten weichen die Peaks jedoch mal mehr mal weniger stark von der Gaußform ab. Zur Wertstoff-Gewinnung wird diese Abweichung sogar bewusst herbeigeführt. Nur so ist es möglich, Wertstoff in großen Mengen und hoher Ausbeute und Reinheit mit möglichst niedrigen Kosten in kurzer Zeit zu gewinnen. Natürlich gilt auch hier: Je schmaler ein Peak und je besser die Basislinientrennung ist, desto größer ist die Reinheit der gesammelten Fraktion. Bei chemisch sehr verschiedenen Substanzen ist diese Trennung leicht zu erzielen, doch je ähnlicher sich die Stoffe sind, desto größer ist die Gefahr, dass deren Peaks überlagern und die Trennung unscharf wird.

Trennung trotz Ähnlichkeit

Der Aufgabe, sehr ähnliche Substanzen quantitativ voneinander zu trennen, standen auch Forscher aus Berlin gegenüber. Professor Süßmuth und sein Team vom Institut für Chemie der TU Berlin haben langjährige Erfahrung in der präparativen HPLC. Sie forschen an dem Peptid Labyrinthopeptin A1 (Lab A1), welches vielversprechende antivirale Wirkung zeigt (anti-HIV, anti-HSV) [1]. Um Struktur-Wirkungsbeziehungen genauer untersuchen zu können, muss es in Reinform vorliegen. Die Hürde ist das Labyrinthopeptin A2: Es hat im Gegensatz zu A1 ein weitaus geringeres Wirkspektrum, ist aber strukturell sehr ähnlich (vgl. Abb. 2 und 3). Daher muss es von dem medizinisch interessanten Lab A1 abgetrennt werden. Eine solche Trennung von chemisch und physikalisch sehr ähnlichen Substanzen ist selbst für Chromatographie-erfahrene Chemiker eine Herausforderung [4].

Die Berliner Forscher nutzten hierfür eine Umkehrphasen(RP)-Chromatographie mit einem Wasser-Methanol-Gemisch als Lösungsmittel. Sie eluierten Lab A1 und Lab A2 im linearen Gradienten bei leichter Erhöhung des Methanol-Anteils. Das bedeutet, die Trennung erfolgte unter Polaritätsänderung des Eluenten. Nun ging es darum, die Labyrinthopeptine Lab A1 und Lab A2 möglichst rein als Fraktionen aus dem Chromatogramm „zu schneiden“. Das kann mithilfe eines automatischen Fraktionssammlers oder über eine intelligente Ventilschaltung und Software erfolgen – oder wie in diesem Beispiel manuell durch den Experimentator, der die richtigen Momente während des Trennvorgangs abpassen muss, um das Eluat hinter dem Detektor nach Erscheinen des Peaks im Chromatogramm aufzufangen.

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Gerade das manuelle Auffangen ist selten zufriedenstellend reproduzierbar und resultiert in unterschiedlichen Fraktionsmengen nach jedem Lauf. Der Verschnitt und die Verwässerung der Substanz werden so möglicherweise unnötig groß. Das Ganze wird erschwert, wenn sich die Substanzen in den Lösungsmitteln nur schlecht lösen und damit die Aufgabemenge auf die Säule von vornherein gering ist. Solch eine Volumenüberladung kann sich durch breite, symmetrische, „bergige“ Peaks im Chromatogramm bemerkbar machen (vgl. Abb. 4), ist jedoch nicht immer zu verhindern. Entscheidend ist, dass für die Wertstoffgewinnung priorisiert wird, welche Substanz in welcher Reinheit gewonnen werden soll, um dann den Fokus der Optimierungsmaßnahmen auf die wichtigste Substanz zu legen. Das Berliner Forscherteam gewann in ihren Versuchen aus 200 mg Substanzgemisch schließlich 2 mg reinen Wertstoff.

Optimierungsmöglichkeiten

Bei der manuellen Fraktionierung ist ein Teil der Zielsubstanz in Mischfraktionen enthalten. Eine Optimierungsmöglichkeit für höhere Ausbeute ist die Wahl der Säule. Wenn diese eine kleinere Korngröße hat, führt dies zu schmaleren, besser aufgelösten Peaks und damit zu kleineren Volumina Mischfraktion. Auch für höhere Flussratenbereiche über 100 ml/min gibt es inzwischen HPLC-Pumpen, die dem höheren Säulendruck bei geringerer Korngröße standhalten, z.B. das Chromophor-Pumpensystem von Advatec Analytics mit Hochdruckstabilität bis 400 bar im Flussbereich bis 250 ml/min. So lassen sich weiterhin hohe Durchsätze erzielen.

Noch bessere Ergebnisse ermöglicht die automatisierte Fraktionierung: In Abb. 5 ist ein Beispiel von Peptid-Trennungen mit einer HPLC-Software dargestellt. Die Software ermöglicht es, die Fraktionen im Chromatogramm zu markieren und synchron mit einem Fraktionssammler zu trennen. D.h. die Fraktionierung der Substanzen erfolgt immer in der gleichen Art und Weise mit hoher Reproduzierbarkeit.

Naturstoffe gewinnen

Ein weiteres Feld, wo Analytik und Gewinnung von Reinsubstanzen wichtig sind, ist die Naturstoff-Forschung. Dazu gehört auch die Isolierung und Strukturaufklärung neuer bioaktiver Acetylenfettsäuren aus afrikanischen Arzneipflanzen, die Dr. Gerold Jerz am Institut für Lebensmittelchemie der TU Braunschweig durchführt. Das Team um Jerz hat mit einem klassischen analytischen HPLC-System bis 400 bar und bis zu 10 ml/min Flussrate Rein­substanzen gewonnen. Es ist also durchaus möglich, mit analytisch ausgelegten Systemen präparativ zu arbeiten. Aufgrund der geringeren Flussrate muss dazu die Probe mehrfach aufgegeben werden – in diesem Beispiel wurden neun Injektionen zu 100 µl gemacht [2].

Fazit

Es kommt immer darauf an, das Ziel zu kennen und darauf basierend die HPLC-Methode zu entwickeln und optimal zu gestalten. Dazu gehört, die Eigenschaften der Probe (z.B. Löslichkeit der Substanzmischung) abzustimmen auf die Eigenschaften des Eluenten (RP- oder Normalphasen-Methode), der HPLC-Säule (z.B. Korngröße), der Flussrate und HPLC-Methode (isokratisch oder Gradient), dem pumpenabhängigen Maximaldruck und dem Fraktionierer.

Literatur:

[1] „The lantibiotic peptide labyrinthopeptin A1 demonstrates broad anti-HIV and anti-HSV activity with potential for microbicidal applications.” Férir G, Petrova MI, Andrei G, Huskens D, Hoorelbeke B, Snoeck R, Vanderleyden J, Balzarini J, Bartoschek S, Brönstrup M, Süssmuth RD, Schols D.PLoS One. 2013 May 28;8(5): e64010. doi: 10.1371/journal.pone.0064010. Print 2013

[2] Gerold Jerz, Dissertation 1999, Universität Erlangen-Nürnberg

[3] Dr. med. Dr. rer. nat. Werner Tegge, Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, Abteilung Chemische Biologie, Braunschweig

[4] “Labyrinthopeptins: A new class of carbacyclic lantibiotics.” Meindl, K. Schmiederer, T., Schneider, K., Reicke, A., Butz, D., Keller, S., Nicholson, G., Gühring, H., Vertesy, L., Wink, J., Hoffmann, H., Brönstrup, M., Sheldrick, G.M., Süssmuth, R.D. Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49(6), 1151-1154

* Dr. S. Kapelle, AdvaTec Analytics GmbH & Co KG, 12489 Berlin

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