HPLC Koffein-Bestimmung durch HPLC mit Direktinjektion

Nimmt der Konsument kein Koffein zu sich, wenn er entkoffeinierten Kaffee trinkt? Eine speziell entwickelte HPLC Methode zur Koffein-Bestimmung zeigt, dass auch entkoffeinierter Kaffee eine nicht unerhebliche Menge Koffein enthält.

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Koffein stimuliert das zentrale Nervensystem und wird daher auch als schmerzhemmende Substanz in Präparaten z.B. gegen Kopfschmerzen und Migräne eingesetzt. Die Aufnahme von Koffein durch Kaffeetrinken ist durchaus gebräuchlich, denn der Konsum von Kaffee ist in weiten Teilen der Erde verbreitet. Wer allerdings entkoffeinierten Kaffee konsumiert, um nur geringe Mengen Koffein zu sich zu nehmen, tut dies nicht zwangsläufig. Mit einer speziellen HPLC-Methode konnte ermittelt werden, dass der Koffeingehalt von kommerziell erhältlichen entkoffeinierten Kaffees im Bereich von 6,6 bis 13,8 Prozent des normalen Kaffees der gleichen Kaffeevertreiber liegt, wobei das zunächst einmal nichts über den absoluten Gehalt aussagt, da ja bereits der reguläre Kaffee unterschiedliche Koffeingehalte aufweist.

Koffein ist neben den Chlorogensäuren die Substanz im Kaffee, von der die größte anregende Wirkung ausgeht. Daneben gibt es eine Vielzahl von Substanzen im Kaffee, die trotz moderner Kopplungstechniken bis heute noch nicht alle identifiziert sind und deren Struktur durch den Röstvorgang zusätzlich verändert wird. Das ist bei Naturprodukten absolut normal und erfordert eine sorgfältige Probenvorbereitung wie Festphasenextraktion oder Flüssig-Flüssig-Extraktion speziell bei der Bestimmung von Substanzen, die nur in geringer Konzentration vorliegen.

Hier wird eine Methode vorgestellt, die Koffein in entkoffeinierten Kaffees unter Verwendung einer modernen Mixed-mode-Phase in einem Säulenschaltsytem online bestimmt. Dabei wird eine Vorsäule so in ein Schaltventil integriert, dass spät eluierende Substanzen die Trennung gar nicht erreichen. Nach Ventilschaltung werden sie hingegen direkt von der Vorsäule mittels Backflush in den Abfall gespült werden.

Die Kaffeproben entstammten aus fertig gebrühten Kaffees, die in den jeweiligen Restaurants gekauft wurden. Wenn das nicht möglich war, wurde 1 g Kaffe in 50 ml Wasser gegeben und 30 Minuten bei 90 °C erhitzt. Anschließend wurde der Kaffee durch ein 0,2 Mikrogramm-Membranfilter filtriert und dann direkt in die HPLC-Anlage injiziert.

Ergebnisse der Koffein-Bestimmung mit HPLC

Das Chromatogramm in Abbildung 1 zeigt die Trennung von entkoffeiniertem Kaffee bei Direktinjektion auf eine Primesep SB-Phase. Diese Phase besitzt eine hydrophobe Kette und eine stark basische funktionelle Gruppe als Anionenaustauscher. Koffein wird bei etwa 12,5 min eluiert und ist gut von den anderen Bestandteilen des Kaffees getrennt. Allerdings eluieren einige Komponeneten im isokratischen Modus erst nach verhältnismäßig langer Zeit. Hier ist eine Laufzeit von fast 60 min erforderlich. Auch eine Gradiententrennung würde relativ lange dauern, zumal ja auch die Rekonditionierungszeit berücksichtigt werden muss.

Um eine akzeptable Analysenzeit zu erreichen, ist eine sorgfältige Probenvorbereitung erforderlich. Dies kann mittels SPE (solid phase extraction) offline erfolgen oder wie in diesem Fall mittels Säulenschaltung und Back-flush. Die Vorsäule beinhaltet die gleiche stationäre Phase wie die Hauptsäule. Allerdings wird sie nicht direkt vor der Trennsäule installiert, sondern in ein Schaltventil integriert.

Wie in Abbildung 2a dargestellt, wird auf die Vorsäule injiziert und, sobald das Koffein die Trennsäule erreicht, das Ventil umgeschaltet. Die sich noch auf der Vorsäule befindlichen Substanzen werden nun rückwärts direkt in den Abfall gegeben (s. Abb. 2b).

Zu Beginn der Injektion durchfließt der Eluent nacheinander Vorsäule, Hauptsäule und Detektor. Nach etwa 0,6 min (abhängig von Systemaufbau und Totvolumen) wird das Ventil umgeschaltet und der Eluent passiert die Vorsäule, den Detektor und erst anschließend die Trennsäule. Die früh eluierenden Substanzen erreichen so die Trennsäule (bis zum Koffein) während die spät eluierenden Substanzen direkt von der Vorsäule zurückgespült werden. So steht die Vorsäule nach erneutem Umschalten am Ende des HPLC-Laufes (nach etwa 14 min.) für die nächste Injektion bereit. Natürlich muss die Schaltzeit des Ventils sehr sorgfältig gewählt werden, weil das Koffein zuverlässig auf der Trennsäule sein muss, die später eluierenden Substanzen aber noch auf der Vorsäule sein müssen. Weiterhin muss beachtet werden, dass die Detektorzelle einen gewissen Rückdruck verträgt, da sich die Vorsäule zeitweise hinter dem Detektorausgang befindet. Die hier gewählte Detektorzelle des Knauer Smartline-UV-Detektors kann bis zu einem Druck von 400 bar betrieben werden.

Das nicht jede RP-Phase eine ausreichende Trennung für diese Problematik erreicht, zeigt der Vergleich in Abbildung 3. Die Trennbedingungen waren gleich, nur der Methanol-Anteil der mobilen Phase wurde entsprechend der Hydrophobizität des Materials angepasst. Man kann deutlich erkennen, dass der Mixed-mode-Mechanismus einen positiven Einfluss auf die Trennung hat und daher auch den bei entkoffeiniertem Kaffee notwendigen geringen Konzentrationsbereich sicher erfasst.

Abbildung 4 zeigt die Gehalte von zwei kommerziell erhältlichen „normalen“ Kaffees und die der entsprechenden entkoffeinierten Varianten.

Die Chromatogramme zeigen, dass bei Starbucks der entkoffeinierte Kaffe nur 6,6 Prozent des Koffeingehaltes des normalen Kaffees hat, bei McDonalds jedoch noch 13,8 Prozent Restkoffein vorhanden sind. Der absolute Koffeingehalt ist jedoch bei McDonalds entkoffeiniertem Kaffee deutlich geringer, da er auch im regulären Kaffee nur ungefähr ein Drittel des Gehaltes von Starbucks-Kaffee beträgt.

Zusammenfassung

Die Bestimmung von Restkoffein in entkoffeiniertem Kaffee bedarf einer sorgfältigen Probenvorbereitung, da sich im Naturprodukt Kaffee eine Vielzahl verschiedener Substanzen befinden, die die Bestimmung von kleinen Mengen Koffein erschweren können. Bei der Auswahl der stationären Phase ist unter den gewählten Bedingungen die Mixed-mode-Phase die am besten geeignete Phase. Verzichtet man auf eine Probenvorbereitung kann die Analysenzeit deutlich verringert werden. Auch können durch Säulenschaltung und Back-flush spät eluierende Substanzen von der Säule ferngehalten werden. Zu beachten ist dabei, dass die Detektorzelle des UV-Detektors eine genügende Druckstabilität aufweist.

Hintergrund: Geräte und Bedingungen

• HPLC-Anlage: Knauer Smartline, bestehend aus Pumpe 1000, Manager 5000 mit Niederdruckgradient- und Degassermodul, Smartline-UV-Detektor 2600, Chromatographiedatensystem ClarityChrom.
• Säule: Primesep SB Vor- und Trennsäule (Sielec Technologies)
• Vergleichssäulen: Zorbax C18 (Agilent Technologies), Atlantis dC18 (Waters), XTerra C18 (Waters)
• Säulendimensionen: Vorsäule: Primesep SB 10 x 4,6 mm, 5µ
• Alle Trennsäulen hatten die gleichen Dimensionen: 250 x 4,6 mm, 5µ
• Flussrate: 1ml/min
• Injektionsvolumen: 1 µl
• Eluent: 0,2 Prozent Phosphorsäure in Methanol:Wasser 20:80
• Detektor-Wellenlänge: 270 nm
• Temperatur: Raumtemperatur

*B. Rittgerodt, Brimus Competence-Center-Chromatography, 87645 Schwangau *Y. Zelechonok, Sielc Technologies, Inc., Prospect Heights/USA

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