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Automatisierte elektrolytische Eluentengenerierung

Kohlenhydrat-Analytik per Ionenchromatographie: Was gibt es Neues?

| Autor / Redakteur: Detlef Jensen* / Dr. Ilka Ottleben

Abb. 1: Schematischer Aufbau der elektrolytischen Eluentengenerierung (RFIC); der KOH-Eluent wird elektrolytisch in der Eluenten-Generator-Kartusche (EGC) hergestellt. (Ausschnitt)
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Abb. 1: Schematischer Aufbau der elektrolytischen Eluentengenerierung (RFIC); der KOH-Eluent wird elektrolytisch in der Eluenten-Generator-Kartusche (EGC) hergestellt. (Ausschnitt) (Bild: Thermo Fisher Scientific)

Kohlenhydrate sind die am häufigsten vorkommende Klasse von Biomolekülen. Ihre Analyse ist nicht immer trivial. Dieser Artikel beschreibt, wie ein hoch automatisiertes Inline-Verfahren zur elektrolytischen Eluentengenerierung bei der Kohlenhydrat-Trennung angewendet werden kann. Basis bilden die moderne Anionenaustauschchromatographie (HPAEC) mit der gepulsten Amperometrie zur Detektion (PAD).

Neutrale Kohlenhydrate sind Polyole mit einem pKs-Wert größer als 12, die bei hohen pH-Werten an stark basischen Anionenaustauschern getrennt werden können (HPAEC). Zur Detektion kommt unter diesen Bedingungen hauptsächlich die gepulste Amperometrie (PAD) zur Anwendung [1, 2, 3]. Moderne Trennsäulen und Detektionsverfahren erlauben eine umfassende chromatographische Bestimmung von Alditolen, Mono-, Di-, Oligo- und Polysacchariden [4, 5].

Die Anwendung kontinuierlich und dynamisch regenerierter „Entsalzer“, auch bekannt als Suppressoren in der klassischen Ionenchromatographie (IC), ermöglichen die Anbindung der HPAEC an die Massenspektrometrie (MS), einem weiteren analytischen Hilfsmittel in der Glykan-Analytik [6]. Die Laufmittel in der HPAEC haben einen hohen pH-Wert und basieren auf wässrigen Lösungen von Natrium- oder Kaliumhydroxid. Die Herstellung solcher Laufmittel erfordert das präzise Einhalten von Vorsichtsmaßnahmen und Abläufen durch alle damit betrauten Labormitarbeiter, um Verunreinigungen über die Absorption von CO2 aus der umgebenden Atmosphäre zu vermeiden [7]. Selbst kleine Abweichungen bei der manuellen Eluentenherstellung beeinflussen die chromatographischen Messungen und tragen zur Unsicherheit der analytischen Ergebnisse bei [8]. Idealerweise sollten sie also vermieden werden.

Ergänzendes zum Thema
 
Herausforderung Kohlenhydrat-Analytik

Resultate und Diskussion

Eine technische Lösung, ursprünglich für die Ionenchromatographie (IC) entwickelt, ermöglicht die Herstellung hochreiner Hydroxid-Eluenten basierend auf einem elektrolytischen Prozess. Dieser Ansatz, bekannt unter der Bezeichnung Reagent-Free Ion Chromatography (RFIC), ermöglicht die In-situ-Herstellung des Laufmittels und vermeidet die Handhabung externer Chemikalien [9, 10].

Abbildung 1 zeigt den generellen Aufbau der RFIC zur Anwendung in der HPAEC-PAD. Der elektrolytische Prozess, in dessen Verlauf Hydroxid aus dem eingespeisten Wasser mit den Gegenionen aus der Thermo Scientific Elugen-EGC-Eluenten-Generator-Kartusche kombiniert werden, erfolgt im Hochdruckbereich des Ionenchromatographen. Hierdurch wird eine Verunreinigung des Laufmittels durch CO2-Aufnahme aus der umgebenden Atmosphäre vermieden, sodass hochreine Eluenten automatisch und anwenderunabhängig erzeugt werden. Die Thermo Scientific Chromeleon-Chromatographie-Software steuert die definierte Hydroxid-Konzentration und das gewählte Elutionsprogramm (isokratisch, Gradient) durch die automatische Anpassung des elektrolytischen Prozesses. Letztlich braucht der Anwender nur Reinstwasser (ASTM Typ I oder besser) zur Verfügung zu stellen.

Abb. 2: Zucker in lignocellulosehaltiger Biomasse-Hydrolysaten. Säule: Thermo Scientific Dionex Carbopac SA10-4µm, Eluent: 1 mmol/L KOH (RFIC-EG), Fluss: 1,5 mL/min, Injektionsvol.: 0,4 µL, Temp.: 45 °C, Detektion: PAD (Au-Elektrode, Zelldichtung: 1,57 mm [62 mil]).
Abb. 2: Zucker in lignocellulosehaltiger Biomasse-Hydrolysaten. Säule: Thermo Scientific Dionex Carbopac SA10-4µm, Eluent: 1 mmol/L KOH (RFIC-EG), Fluss: 1,5 mL/min, Injektionsvol.: 0,4 µL, Temp.: 45 °C, Detektion: PAD (Au-Elektrode, Zelldichtung: 1,57 mm [62 mil]). (Bild: Thermo Fisher Scientific)

Diese Gerätekonfiguration ist zur Bestimmung von Mono-, Di- und Oligosacchariden sowie Aminoglykosiden geeignet. Abbildung 2 zeigt die schnelle Trennung von Biokraftstoff-Zuckern in Biomasse-Hydrolysaten. Patil et al. setzten eine Dionex Carbopac-SA10-4µm-Trennsäule ein, um sowohl die analytische Laufzeit zu verkürzen (Injektionstakt <10 min) und gleichzeitig die chromatographische Auflösung zu verbessern [11]. Um eine starke Verdünnung der Probe zu vermeiden und die Linearität der Kalibrierfunktion hin zu höheren Konzentrationen zu verschieben, kam ein kleines Injektionsvolumen und eine dickere Zelldichtung (engl.: gasket) zum Einsatz [12]. Beachtenswert sind die geringe Ionenstärke des Laufmittels und die hohen Zuckerkonzentrationen in diesem Anwendungsbeispiel.

Der Ansatz der Eluentengenerierung kommt ebenfalls zur Tobramycin-Gehaltsbestimmung und der Quantifizierung elektroaktiver Verunreinigungen in Tobramycin-basierten Formulierungen zum Einsatz. Die Aminoglykoside wurden an einer Dionex Carbopac PA1 mit einem KOH-Eluenten (2 mmol/L, 0,5 mL/min) getrennt und mit der PAD erfasst. Abbildung 3 zeigt ein Chromatogramm von Tobramycin und darin enthaltenen Kanamycin-Verunreinigungen [13].

Abb. 3: Tobramycin mit Spuren an Kanamycin A und B. Säule: Dionex Carbopac PA1, Eluent: 2 mmol/L KOH (RFIC-EG), Fluss: 0,5 mL/min, Injektionsvol.: 20 µL, Temp.: 30 °C, Detektion: PAD (Au-Elektr., Zelldichtung: 51 µm [2 mil]; AAA Pulssequenz).
Abb. 3: Tobramycin mit Spuren an Kanamycin A und B. Säule: Dionex Carbopac PA1, Eluent: 2 mmol/L KOH (RFIC-EG), Fluss: 0,5 mL/min, Injektionsvol.: 20 µL, Temp.: 30 °C, Detektion: PAD (Au-Elektr., Zelldichtung: 51 µm [2 mil]; AAA Pulssequenz). (Bild: Thermo Fisher Scientific)

Der Injektionszyklus wurde optimiert (alle 16 Minuten), sodass der Sauerstoff-Peak der vorherigen Injektion (eine Senke in der Basislinie als Resultat unterschiedlicher Sauerstoffgehalte von Probe und Eluent) die Quantifizierung der Zielkomponenten nicht stört. Die analytischen Bedingungen erlauben die Bestimmung von Verunreinigungen in Tobramycin und in anderen Aminoglykosiden wie Neomycin und Paromomycin [14, 15]. Die Elution von Streptomycin und Amikacin erfordert höhere Hydroxid-Konzentrationen [16, 17].

Zusätzlich zu den HPAEC-Ansätzen steht mit der Thermo Scientific Dionex Ionpac AmG C18 eine neue Trennsäule zur Ionenpaartrennung der Aminoglykoside zur Verfügung; zur Detektion kann hier die PAD oder Charged-Aerosol-Detektion eingesetzt werden [18].

Abb. 4: Analyse von TFA- und HCl-Hydrolysaten von Rinder-Fetuin. Säule: Dionex Carbopac PA20-Fast-4µm (2 × 100) mm, Eluent: KOH-Gradient (RFIC-EG), Fluss: 0,22 mL/min, Injektionsvol.: 2.5 µL, Temp.: 30 °C, Detektion: PAD (Au-Elektr., Zelldichtung: 51 µm).
Abb. 4: Analyse von TFA- und HCl-Hydrolysaten von Rinder-Fetuin. Säule: Dionex Carbopac PA20-Fast-4µm (2 × 100) mm, Eluent: KOH-Gradient (RFIC-EG), Fluss: 0,22 mL/min, Injektionsvol.: 2.5 µL, Temp.: 30 °C, Detektion: PAD (Au-Elektr., Zelldichtung: 51 µm). (Bild: Thermo Fisher Scientific)

Abbildung 4 zeigt ein drittes Beispiel für den Einsatz der KOH-Eluenten-Generierung in der HPAEC-PAD. Patil et al. verwendeten eine 4-µm-Partikelvariante der Dionex Carbopac PA20, um die Trennung von Monosacchariden und Aminozuckern aus HCl- und TFA-Hydrolysaten von Proteinen zu optimieren. Der kleinere Teilchendurchmesser dieser Säule resultiert in höheren Peak-Effizienzen, die zu höherer chromatographischer Auflösung führen. Damit ist der Einsatz einer kürzeren Trennsäule gerechtfertigt, der letztlich in kürzeren Laufzeiten und einem höheren Probendurchsatz mündet. Die Elution der Zielkomponenten ist in sechs Minuten abgeschlossen, und die Gesamtlaufzeit, den Spül- und Regenerationsschritt einschließend, beträgt zwanzig Minuten [19].

Aggrawal et al. demonstrierten den Einsatz der RFIC zur Untersuchung von Zuckern (Mono- bis Oligosaccharide) in Honig. Sie verwendeten die Dionex Carbopac PA210-4µm zum Nachweis von Minorzuckern in der Gegenwart hoher Konzentrationen an Glucose und Fructose. Diese Anwendung ermöglicht den Nachweis des verfälschenden Zusatzes industrieller Zuckersirupe zu Honig [20].

Die in den diskutierten Beispielen verwendeten KOH-Eluenten (isokratisch, Gradient) wurden elektrolytisch, inline und anwenderunabhängig im Hochdruckbereich des Systems erzeugt. Die akkurat eingestellten Eluenten sind die Voraussetzung für präzise Retentionszeiten und reproduzierbare, verlässliche analytische Resultate.

Abb. 6: Inulin-Trennung unter Einsatz des Dual-EGC-Modus. Säule: Dionex CarboPac PA200 (1 × 250) mm, Eluent: KOH/KMSA-Gradient (RFIC, Dual-EGC-Modus), Fluss: 0,22 mL/min, Injektionsvol.: 2,5 µL, Temp.: 30 °C, Detektion: PAD (Au-Elektrode, Zelldichtung: 25.4 µm [1 mil]) [24].
Abb. 6: Inulin-Trennung unter Einsatz des Dual-EGC-Modus. Säule: Dionex CarboPac PA200 (1 × 250) mm, Eluent: KOH/KMSA-Gradient (RFIC, Dual-EGC-Modus), Fluss: 0,22 mL/min, Injektionsvol.: 2,5 µL, Temp.: 30 °C, Detektion: PAD (Au-Elektrode, Zelldichtung: 25.4 µm [1 mil]) [24]. (Bild: Thermo Fisher Scientific)

Die Chromatographie von Oligo- und Polysacchariden erfordert eine zusätzliche Komponente im Eluenten, das „Pushing Ion“, wie Acetat oder Nitrat [5, 21]. Diese Komponente beschleunigt die Elution stärker zurückgehaltener Spezies ohne die Selektivität oder die gepulste amperometrische Detektion zu beeinflussen. Noch bis vor kurzem konnten solche Eluenten ausschließlich manuell hergestellt werden. Nach der Einführung eines neuen RFIC-Modus zur Eluentengenerierung, dem dualen Kartuschenmodus (Dual EGC, s. Abb. 5), sind Eluenten zur chromatographischen Analyse komplexer Kohlenhydrate elektrolytisch zugänglich. In diesem neuen Modus werden in einem RFIC-System eine Methansulfonsäure- (MSA) und eine KOH-EGC-Kartusche seriell kombiniert, um KOH/KMSA-Eluenten (isokratisch, Gradient) elektrolytisch zu generieren. Diese Betriebsart kommt mit Säulen im analytischen Format (1 mm) aber auch im Kapillarformat (0,4 mm) zum Einsatz. Huang et al. wendeten den Dual-EGC-Modus zur Charakterisierung von Galactooligosacchariden (GOS) [22] und bei der Untersuchung N-glykosilierter Oligosaccharide aus Glykoproteinen an [23]. Sie verwendeten die Dionex Carbopac-PA200-Trennsäule im 1-mm-Format. Das Inulin-Chromatogramm in Abbildung 6 (s. online) ist ein repräsentatives Beispiel zum Einsatz des Dual-EGC-Modus zur Gradienten-Trennung stärker zurückgehaltener Polysaccharide.

Zusammenfassung

Der Einsatz der elektrolytischen Eluentengenerierung in der HPAEC-PAD optimiert die einheitliche Herstellung von KOH-Eluenten geringer Ionenstärke, oder die von KOH-Gradienten zur Elution kleiner Saccharide. Die Methoden-Reproduzierbarkeit für Retentionszeiten und Peakflächen steigt und wird anwenderunabhängig.

Der Dual-EGC-Modus versetzt den Anwender in die Lage, stärker zurückgehaltene Oligo- und Polysaccharide mit elektrolytisch erzeugten KOH/KMSA-Eluenten zu trennen. Es ergibt sich eine verbesserte Reproduzierbarkeit, die manuelle Herstellung von Eluenten wird umgangen und die Geräteverfügbarkeit steigt. Der Dual-EGC-Modus zeigt eine ausgezeichnete Leistung beim Einsatz in der HPAEC-PAD von komplexen Kohlenhydraten.

In seinen verschiedenen Betriebsmodi verbessert die RFIC die Reproduzierbarkeit der analytischen HPAEC-IPAD-Messung und gewährleistet eine höhere Genauigkeit und Vergleichbarkeit zwischen Instrumenten sowie zwischen Laboratorien.

Inhalt des Artikels:

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