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Automatische Pipettiersysteme Minimierung des Reaktionsvolumens in der Real-Time-PCR

Autor / Redakteur: Daniel Wehrhahn* / LP-Redaktion

Automatische Pipettiersysteme verbessern die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit von Real-Time-PCR-Reaktionen. Nach wie vor sind die sehr teuren Reagenzien ein Nachteil der Real-Time-PCR. Oft verhindern sie, dass diese Methode in noch größerem Umfang genutzt wird. Hier zeigt sich ein weiterer wichtiger Vorteil der automatischen Pipettiersysteme. Das Reaktionsvolumen kann bei gleichbleibend hoher Präzision auf ein Minimum reduziert werden, sodass sich Reagenzien einsparen lassen.

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Abb. 1 Automatische Pipettiersysteme wie die Eppendorf epMotion 5070 minimieren die Kosten der Real-Time-PCR für ein Labor mit mittlerem bis kleinem Probendurchsatz.
Abb. 1 Automatische Pipettiersysteme wie die Eppendorf epMotion 5070 minimieren die Kosten der Real-Time-PCR für ein Labor mit mittlerem bis kleinem Probendurchsatz.
( Archiv: Vogel Business Media )

Die Real-Time-PCR hat sich in wenigen Jahren zu einer der wichtigsten Amplifikations- und Analysetechniken von DNA und RNA entwickelt. Mittlerweile bildet sie den Standard in der molekularbiologischen Forschung, bei angewandten Testverfahren und in der molekularen Diagnostik.

Die technologische Entwicklung konzentrierte sich in letzter Zeit vor allem auf immer kürzere Laufzeiten und bessere Reproduzierbarkeiten in der Real-Time-PCR. Eine große Herausforderung liegt in der Standardisierung der Ergebnisse. Zum einen zeigt sich oft eine nicht unerhebliche Variabilität zwischen verschiedenen Ansätzen desselben Assays. Zum anderen zeigte Bustin schon 2002 [1], dass auch unterschiedliche Personen signifikante Abweichungen bei der Pipettierung von Real-Time-PCR-Reagenzien erzeugen können. Diese Ergebnisse führten zu der Empfehlung, für den Ansatz der Reaktionen ein automatisiertes Pipettiersystem zu verwenden. In vielen Labors wird jedoch weiterhin von Hand pipettiert, da die Anschaffung eines automatischen Pipettiersystems bei kleinen Probenmengen zu teuer erscheint.

Reagenzienkosten für die Real-Time-PCR

Die enormen Reagenzienkosten, vor allem in Zeiten knapper Budgets, stellen einen großen Nachteil der Real-Time-PCR dar. Ein Standard 50-µl-SYBR-Green-Assay kostet zum Beispiel durchschnittlich 1,60 Euro pro Reaktion, ein Taqman-Assay auf Grund der teureren Sonde sogar 2,00 Euro. Die Reduktion des Probenvolumens bietet deshalb einen vielversprechenden Lösungsansatz. Mit kleineren Volumina steigt allerdings auch der Anspruch an eine präzise Pipettierung der Proben und Reagenzien. Reproduzierbares Pipettieren selbst kleinster Probenvolumina ist in der Regel nur mit einem automatischen Pipettiersystem möglich.

Automatisches Pipettiersystem

Ausgelegt auf bis zu 96 Proben pro Lauf bietet ein automatisches Pipettiersystem wie die Eppendorf epMotion 5070 die Lösung für viele Labore mit kleinem bis mittlerem Probendurchsatz. Steigt das Probenaufkommen ist das System flexibel auf 384er Platten erweiterbar. Die Standardisierung der Abläufe reduziert die Fehler der Pipettierung. Reaktionen mit zehn und fünf Mikroliter Ansatzvolumen werden, unabhängig von der Erfahrung und dem Geschick des Anwenders, mit höchster Genauigkeit pipettiert. Zusammen mit einem schnellen und präzisen Real-Time-Cycler wie dem Eppendorf Mastercycler ep realplex kann gleichzeitig auch die Reaktionszeit entscheidend verkürzt werden. Die gleichbleibend hohe Reproduzierbarkeit und Genauigkeit in einem Standard TaqMan-Assay bei einer stark verkürzten PCR-Laufzeit von nur 24 Minuten ist in Abbildung 2 dargestellt. Der Vergleich der Standardabweichungen beim manuellen Ansatz von zehn-Mikroliter-Reaktionen durch einen erfahrenen Labormitarbeiter mit denen des automatisierten Ansatzes zeigt, dass sich die Genauigkeit und damit die Qualität der Analyse erhöht (s. Abbildung 3). Selbst Reaktionsvolumina bis zu fünf Mikroliter sind, abhängig vom Real-Time-PCR-Cycler, mit der epMotion problemlos anzusetzen. Dies ist manuell kaum möglich.

Kostenersparnis

Das automatische Pipettieren mit der epMotion ermöglicht es, durch Verkleinern der Probenvolumina Reagenzienkosten einzusparen. Selbst Labore mit sehr geringem Probendurchsatz profitieren hiervon. Bei einem Standard-SYBR-Green-Real-Time-Assay können mehrere Tausend Euro Ersparnis pro Jahr zusammen kommen (Tabelle 1). Rechnet man den günstigen Anschaffungspreis eines kleinen automatischen Pipettiersystems dagegen, amortisiert sich die Investition oft schon nach wenigen Monaten.

Fazit

Schnelle, verlässliche und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen sind das Ziel eines jeden Labors im Bereich der medizinischen Forschung und Diagnostik. Der ständig steigende Kosten- und Zeitdruck macht es den Mitarbeitern im Labor schwer, die Qualität der Analysen, insbesondere bei so kosten- und arbeitsintensiven Methoden wie der Real-Time-PCR, weiter zu verbessern. Automatisches Pipettieren kann dabei helfen, da es Pipettierfehler vermeidet, die Reproduzierbarkeit erhöht und Ergebnisse auch zwischen unterschiedlichen Laboren und Mitarbeitern vergleichbar macht. Darüber hinaus reduziert das System den manuellen Aufwand und schafft somit mehr Zeit für die Ergebnisbeurteilung.

Die Reagenzienkosten können auf ein Minimum gesenkt werden. Vielseitige Systeme, wie die epMotion, sind außerdem ideal geeignet für alle Routinepipettiervorgänge in verschiedenen Labors. Dazu gehören der Probentransfer von Röhrchen auf Platten, das Erstellen von Verdünnungsreihen und enzymatischen Assays wie Elisa sowie das Reformatieren von Platten.

* Dr. D. Wehrhahn, Eppendorf AG, 22339 Hamburg

Literatur:[1] Bustin SA. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J. Endocrinology. 2002;29:23-39.

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