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Filtration

Mit Cross-Flow-Filtration größere Volumina aufkonzentrieren

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Hierfür werden zwei Liter Wasser aus dem Zuchtbecken mit Vivaflow 200 mit einer Poly-ethersulfon-Membran (100 kDa) auf 80 Milliliter aufkonzentriert. Diese Anreicherungsprozedur ist besonders schonend und in weniger als einer halben Stunde durchzuführen. Anschließend wird die virale RNA aus der aufkonzentrierten Probe extrahiert und mittels Real-Time-PCR nachgewiesen. Virenmengen von nur 5,5 Viren pro Milliliter (Tissue Culture Infectiouns Dose TCID50, antivirale Aktivität 1,6 x 10-2 ml-1) konnten mit dieser Methode erfolgreich nachgewiesen werden.

Auch Bakterien und Phytoplankton aus Gewässerproben können über Vivaflow aufkonzentriert werden. Dies wurde von einem Team um Marjolojn Tijdens [2] mit einer Serie von Wasserproben aus dem Lake Loosdrecht – einem seichten, eutrophischen See in den Niederlanden – durchgeführt. Hier sollte die dynamische Zusammensetzung der Wasserorganismen in Abhängigkeit von der Jahreszeit und das damit zusammenhängende Virusaufkommen in dem See bestimmt werden. Nach der erforderlichen Konzentration von zwei Litern Seewasser um das vierzigfache mit Vivaflow 200 mit einer Polyethersulfon-Membran (30 kDa), wurden die Mikroorganismen mittels Epifluoreszenz-Mikroskopie und Pulsed-Field-Gelelektrophorese (PFGE) nachgewiesen.

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Je nach Jahreszeit konnten hier 5,5 x 107 bis 1,3 x 108 virenartige Partikel pro Milliliter detektiert werden. Für diese Applikation eignen sich die Vivaflow-Einheiten besonders gut, da die Probenvorbereitung sehr schnell vor Ort erfolgen musste, um eine exakte Zustandsaufnahme des Gewässers zu garantieren.

Aufreinigung des Glykoproteins Avidin aus Zellkultur-Überstand

Aber auch für die Konzentration von Proteinen aus Medienüberständen eignet sich Vivaflow. Wissenschaftler um Andrea Zocchi von der Universität im schweizerischen Neuchâtel [3] berichten über die Aufreinigung eines rekombinanten, glykolysierten Avidins (recGAvi) aus der Hefe Pichia pastoris. Natives Avidin ist ein Glykoprotein aus Hühnerei, das Biotin (Vitamin H) binden kann und so beispielsweise die Carboxylierung von Pyruvat hemmt. RecGAvi wurde von P. pastori in den Kulturüberstand exprimiert. Vor der Aufreinigung des Proteins wurde der Fermenterüberstand, welcher 330 mg/l recGAvi enthielt, abzentrifugiert und über Viva-flow 200 (30 kDa Polyethersulfon-Membran) auf 50 ml einkonzentriert und dabei gleichzeitig mit einer Pufferlösung (0,05 M NaHCO3 und 0,5 M NaCl) auf pH 9,8 umgepuffert.

Dies ist bei einer Cross-Flow-Applikation ohne weiteres möglich, indem man ein geschlossenes System erzeugt, welches in dem Maße einen neuen Puffer aus einem Reservoir in die konzentrierte Probe zieht, wie Filtrat abgeführt wird. Ein entsprechender Versuchsaufbau ist in Abbildung 2 dargestellt. So kann ein bis zu 99-prozentiger Pufferaustausch erreicht werden. Die aufkonzentrierte und umgepufferte Rec-Avidin-Probe konnte danach mittels Affinitätschromatographie mit 2-Iminobiotin-Agarose aufgereinigt werden.

Cross-Flow-Filtration auch fürs Labor geeignet

Die Cross-Flow-Filtration kann auch im Labor in vielen unterschiedlichen Applikationen gut eingesetzt werden, wie die vorhergehenden Beispiele zeigen. Vor allem, wenn es um die Aufkonzentration bzw. um das Umpuffern von biologischen Proben geht, spielt die Technik ihre aus dem Prozessmaßstab schon bekannten Vorteile aus. Sie erleichtert und beschleunigt das Arbeiten, indem langwierige Zentrifugationsschritte ersetzt werden.

Neuartige Cross-Flow-Systeme wie die Vivaflow von Sartorius Stedim Biotech sind zudem auf die Bedürfnisse im Labormaßstab ausgelegt. Diese Sartorius-Einheit eignet sich damit optimal für das zuverlässige und schnelle Aufarbeiten von Proben mit einem Volumen von bis zu fünf Litern. Mit dem entsprechenden Zubehör wie Spinnerflaschen kann das Filtrationssystem weiterhin individuell auf die benötigten Anwendungen zugeschnitten werden.

[1] Microb Ecol. 2008 July; 56(1): 29–42. Population Dynamics and Diversity of Viruses, Bacteria and Phytoplankton in a Shallow Eutrophic Lake, Marjolijn Tijdens et al. Department of Microbial Wetland Ecology, Centre for Limnology, Netherlands Institute of Ecology

[2] Journal of Plankton Research 2008 30(3):261-273 Microbial dynamics during the decline of a spring diatom bloom in the Northeast Atlantic Carole A. Llewellyn et al. 1 Plymouth Marine Laboratory, Prospect Place, The Hoe, Plymouth PL1-3DH, UK

[3] Protein Expression and Purification 32 (2003) 167–174, Expression and purification of a recombinant avidin with a lowered isoelectric point in Pichia pastoris, Andrea Zocchi et al. Institut de Chimie, Universite de Neuchatel, Av. de Bellevaux 51, CH-2000 Neuchatel, Switzerland ie

*Dr. N. Delmdahl, Senior Produktmanagerin, Sartorius Stedim Biotech, 37070 Göttingen

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