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Biomarker Mit Maldi-Imaging auf der Biomarkersuche

Autor / Redakteur: Rene C. Krieg*, Kristina Schwamborn* und Axel Wellmann** / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Zur Proteomanalyse werden Massenspektrometrie und 2-D-Gelelektrophorese eingesetzt. Die MS-Spektren sind vergleichbar mit einem Fingerabdruck und hilfreich bei der Entdeckung spezifischer Biomarker. Das Maldi-Imaging ist eine neue Technik, die Proteom-Daten mit histologischer Information eindeutig verknüpft. Mittels komplexer Klassifizierungsalgorithmen lassen sich zudem neue diagnostische Anwendungen eröffnen.

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Gesundes Gewebe bei einer histologischen Untersuchung.
Gesundes Gewebe bei einer histologischen Untersuchung.
( Archiv: Vogel Business Media )

Das zelluläre Proteom umfasst die Gesamtheit aller von einer Zelle gleichzeitig exprimierten Proteine. Man nimmt an, dass mindestens 10 000 verschiedene Proteine pro Zelle gewebetypisch vorkommen. Es ist ein Indikator für zelluläre Vitalitätsgrade und Zustände. Sie können die Spanne vom Normalzustand über harmlose entzündliche Reaktionen bis hin zur malignen Entartung umfassen (Biomarker).

In der Pathologie werden routinemäßig Gewebeproben mikroskopisch aufgearbeitet [1] und histopathologisch analysiert. Die Techniken hierfür werden seit 100 Jahren nahezu unverändert angewandt. Für spezielle diagnostische Fragestellungen werden zunehmend Proteinexpressionen einbezogen. Mithilfe immunhistochemischer Verfahren werden Schlüsselproteine (z.B. Keratine, Immunglobuline, Differenzierungsproteine und „drugable targets“ wie Her2Neu) hinsichtlich ihrer Expression untersucht. Dies wird mit der Morphologie korreliert und erlaubt Rückschlüsse auf Differenzierung, Herkunft und letztlich auch Dignität. In der Routinediagnostik werden rund 50 Antikörper erfolgreich eingesetzt.

Probenvorbereitung

Um das Proteom von solidem Gewebe zu analysieren, muss es in der Regel lysiert werden. Die Lysepuffer-Reagenzien müssen sorgfältig auf die sich anschließende Analyse angepasst werden, um diese nicht negativ zu beeinflussen. Ferner muss vorab häufig eine Mikrodissektion durchgeführt werden. Dies kann je nach Fragestellung und geforderter Mindestzellmenge ein aufwändiger Prozess sein. Die Mikrodissektion erlaubt eine schonende Abtrennung einzelner Zellen aus dem Gewebeverband auf mikroskopischer Ebene. Sie ist unumgänglich, wenn die Proteinexpression von Zellpopulationen, z.B. Tumorzellen, gezielt analysiert werden sollen. Die Lyse eines kompletten Gewebeverbandes würde neben dem Proteom der Tumorzellen auch alle Proteine von gesunden Zellen enthalten und so das Ergebnis verfälschen. Gewisse biologische Entitäten (z.B. CIS, carcinoma in situ) bestehen per se nur aus wenigen Zellen, sodass die zur Analyse geforderte Mindestzellmenge unter Umständen nicht zur Verfügung steht.

Analyse des Proteoms

Prinzipiell existieren drei Möglichkeiten, das Proteom nach Probenvorbereitung zu analysieren. Die 2D-Gelelektrophorese [2, 3] basiert auf der Auftrennung der Proteine anhand ihres isoelektrischen Punktes (IEP) und anschließender Auftrennung nach der molekularen Masse mittels Gel-elektrophorese. Dieses Verfahren ist immernoch von großem Nutzen, da es die uneingeschränkte Analyse komplexer Proteinmischungen erlaubt. Allerdings ist es zeitaufwändig, kaum automatisierbar und oft nicht reproduzierbar.

Die zweite Methode ist die Massenspektrometrie (MS). Erst die Einführung der Maldi-Tof-MS (matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight MS) als sanfte Ionisierungstechnik ermöglichte es, große Moleküle zerstörungsfrei zu analysieren [3]. Bis vor wenigen Jahren lagen die Hauptanwendungen in der exakten Massenbestimmung, der Sequenzierung von Proteinen sowie der Spurenanalytik in Verbindung mit HPLC. Insbesondere die Vorarbeiten von Liotta und Petricoin (NIH, NCI) führten zu einer weiteren Anwendung, die eine neue Dimension der klinischen Diagnostik erreichen könnte [4].

Das MS-Spektrum einer biologischen Probe ist charakteristisch wie ein Fingerabdruck und spiegelt das zugrunde liegende Proteom wieder. Der Vergleich von MS-Spektren einer gesunden Probe (z.B. Serum) mit einer erkrankten Probe kann einen Massenpeak liefern, der krankheitsspezifisch ist (pattern profiling). Wenn das krankheitspezifische Auftreten dieses Peaks empirisch bestätigt wird, kann dieser für einen diagnostischen Test verwendet werden. Die Identität des Proteins, das den besagten Peak verursacht, ist in diesem Zusammenhang zweitrangig. Mit dieser Methode können Proteine in einem typischen Massenbereich von 1 bis 100 kDa analysiert werden, wobei der Informationsgehalt ab 25 kDa rapide abnimmt. Die Sensitivität liegt im femto-Molbereich (10 bis 15 Mol). Es lassen sich damit praktisch alle klinisch relevanten Probenarten untersuchen, wenn sie Proteine enthalten.

Maldi-Imaging

Maldi-Imaging umgeht die notwendige Mikrodissektion und erlaubt es, abstrakte massenspektrometrische Daten (Spektren) unmittelbar mit der Morphologie des Gewebes zu verknüpfen.

Zunächst wird ein 10 µm dicker Kryostatschnitt des betreffenden Gewebes angefertigt. Dieser wird auf einen Glasobjektträger aufgezogen, der mit Indium und Zinnoxid beschichtet ist, um elektrisch leitfähig zu sein. Nach einem kurzen Fixierschritt in Ethanol wird die Matrixsubstanz (Sinapinic Acid) aufgebracht. Die Matrix wird durch gezieltes Aufsprühen der gelösten Substanz in gleichmäßigen Schichten aufgebracht, wodurch das Gewebe gleichförmig mit kleinen Matrixkristallen überdeckt wird. Nach der Probenpräparation wird der Schnitt mittels Maldi-Tof vermessen. Die Lyse der Proteine ist nicht nötig; durch deren Interaktion mit der Matrix sowie dem UV-Laser des Massenspektrometers (von Bruker Daltonik, Bremen) werden sie unmittelbar der Analyse zugänglich gemacht.

Mit einer speziellen Steuersoftware (Flex-Imaging in Verbindung mit Flex-Control; Bruker) wird auf dem Gewebe ein virtuelles Raster von Messpunkten im Abstand von typischerweise 50 bis 200 µm erzeugt. Von jedem Messpunkt wird ein Massenspektrum erzeugt. Je nach Schnittgröße werden automatisch mehrere Tausend Spektren erzeugt, die jeweils ortskorreliert abgespeichert werden. Der Schnitt wird anschließend mit organischen Lösungsmitteln von der Matrix befreit und routinemäßig mit Hämatoxilin-Eosin (HE) gefärbt. Zur Analyse werden die Spektren in einem ersten Schritt farbkodiert wiedergegeben und eine „Massenlandkarte“ erzeugt (s. Abb. 1). Die virtuelle Massenlandkarte wird mit dem digitalen Bild des verwendeten Schnittes nach HE-Färbung überlagert. Somit ist eine unmittelbare Korrelation der massenspektrometrischen Daten mit der realen Histologie gegeben (Mass-Imaging). Die routinemäßig anwendbare Auflösung liegt derzeit bei 50 µm. Technisch möglich sind heute schon 10 µm. Die feingewebliche Verteilung von Molekülen definierter Masse (Pharmazeutika, Metaboliten) im Gewebe kann so exakt dargestellt werden [5-8].

Im zweiten Schritt der Auswertung werden am HE-gefärbten Präparat gesunde Gewebsanteile bzw. Tumorareale als ROIs (regions of interest) definiert. Innerhalb dieser Areale generierte Spektren werden zur Analyse exportiert. Basierend auf einer Auswertesoftware (Clinpro-Tools, Bruker) werden mittels Pattern-Profiling Algorithmen gesucht, die eine Klassifizierung der Spektren (gesund gegen Tumor) erlaubt. Dies erfolgt mit mehreren unabhängigen mathematischen Modellen (Genetic-Algorithm-Software, Support-Vector-Machine, Quick-Classifier) und vielen hundert Spektren pro ROI, sodass sich eine hohe statistische Validität ergibt. Der gefundene Algorithmus kann z.B. die tumorspezifische, komplexe wechselseitige Expression von fünf verschiedenen Proteinen erkennen und diese zur Klassifikation verwenden. Die Software untersucht einen einmal gefundenen Algorithmus automatisch auf seine Klassifizierungsgüte. Dies geschieht im einfachsten Fall durch interne Cross-Validierung, welche die Güte als Sensitivität und Spezifität angibt. Der Algorithmus ist in der Lage, weitere beliebige Spektren zu klassifizieren. Das Ergebnis lässt sich in Flex-Imaging farbcodiert darstellen. Die Klassifizierung kann im einfachsten Falle dazu dienen, neben den zur Berechnung des Algorithmus verwendeten ROIs den gesamten Schnitt zu analysieren.

Wichtiger jedoch ist die Möglichkeit, einen weiteren, unbekannten Schnitt zu klassifizieren. Daraus ergeben sich potenzielle klinische Anwendungen. An einer signifikanten Fallzahl von gesunden bzw. erkrankten Schnittpräparaten wird mittels Maldi-Imaging ein Klassifizierungsalgorithmus erstellt, der wie in einem der in Aachen durchgeführten Projekte zur MS basierten Identifikation von Karzinomen in Prostataschnittpräparaten führte [10]. Dieser kann weitere Schnittpräparate klassifizieren, also diagnostizieren. Die Klassifizierung hängt nicht mehr von der Histologie ab, sondern von der im Präparat vorgefundenen Proteinexpression. Durch die farbkodierte Darstellung ist die Auswertung der Daten sehr leicht möglich. Die konstruktive Zusammenarbeit von klinisch tätigen Ärzten und Wissenschaftlern fördert auch hier neue Wege der Diagnostik.

Literatur

[1] Burck HC: Histologische Technik. 104 ff, 6. Auflage, Georg Thieme Verlag Stuttgart, 1988.

[2] O’Farrel P: High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem 1975; 250: 4007-4021.

[3] Gorg A, Obermaier C, Boguth G, et al.: The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis 2000; 21(6): 1037-53.

[4] Hillenkamp F, Karas M: Mass spectrometry of peptides and proteins by matrix-assisted ultraviolet laser desorption/ionization. Methods Enzymol 1990; 193: 280-95.

[5] Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, et al.: Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet 2002; 359(9306): 572-7.

[6] Caldwell RL and Caprioli RM: Tissue profiling by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics 2005; 4(4): 394-401.

[7] Caprioli RM, Farmer TB, Gile J: Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF-MS. Anal Chem 1997; 69: 4751-60.

[8] Chaurand P, Schwartz SA, Billheimer D, Xu BJ, Crecelius A, Caprioli RM: Integrating histology and imaging mass spectrometry. Anal Chem 2004; 76: 1145-55.

[9] Chaurand P, Stoeckli M, Caprioli RM: Direct profiling of proteins in biological tissue sections by MALDI mass spectrometry. Anal Chem 1999; 71: 5263-70.

[10] Schwamborn K, Krieg RC, Reska M, Jakse G, Knuechel R, Wellmann A: MALDI-Imaging in prostate cancer. Int J Mol Med 2007; Int J Mol Med. 2007 Aug;20(2):155-9.

*Dr. R. C. Krieg, Dr. K. Schwamborn, Institut für Pathologie, RWTH Aachen, 52074 Aachen **Prof. Dr. A. Wellmann, Pathologisches Institut Celle, 29223 Celle

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