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Mutationsscreening

Molekularbiologische Technik bestimmt metabolische Kapazität

| Autor/ Redakteur: Horst Hannig*, Sonja Farhangi** ?und Laura Kanto*** / Dr. Ilka Ottleben

Nicht jeder Mensch metabolisiert ein ihm verabreichtes Medikament auf die gleiche Art und Weise. Es gibt individuelle Variabilitäten, die zum Teil in unserer Erbsubstanz begründet liegen. Infolgedessen sind Medikamente unterschiedlich wirksam und verträglich. Neue molekularbiologische Techniken wie z.B. Mutationsscreenings können dabei helfen, Therapien individueller zu gestalten.

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Abb. 1 Rote Blutzellen bilden die Grundlage für das Invitek Invimag Blood Mini Kit/KFml zur Isolation genomischer DNA aus Vollblut.
Abb. 1 Rote Blutzellen bilden die Grundlage für das Invitek Invimag Blood Mini Kit/KFml zur Isolation genomischer DNA aus Vollblut.
( Archiv: Vogel Business Media )

Medikamenten-Stoffwechselprozesse unterliegen individuellen Variabilitäten, die zunehmend besser verstanden werden. Daher wird ihnen bei der Gestaltung medikamentöser Therapien eine wachsende Bedeutung zugemessen. Die Entdeckung pharmakogenetischer Polymorphismen trägt hierzu auf molekularer Ebene bei. Daneben ermöglichen neue molekularbiologische Techniken immer häufiger eine Prognose der individuellen metabolischen Kapazität von Patienten. Die hierfür eingesetzten Verfahren müssen sich insbesondere im Hinblick auf therapeutische Zwecke durch hohe Effizienz und Sensitivität auszeichnen. So müssen sich Nukleinsäuren in großer Probenzahl schnell und sensitiv isolieren und detektieren lassen.

Detektion des DPYD-Gens

Das Beispiel beschreibt die DNA-Isolierung aus humanen Vollblutproben und die Detektion einer Mutation des Dihydropyrimidin-Dehydrogenase-Gens (DPYD) mithilfe des Invimag Blood Mini Kit/KFmL (Invitek) und des Magnetpartikelprozessors Thermo Scientific Kingfisher mL (Thermo Fisher Scientific) in Kombination mit einem PCR-Detektionsverfahren. Für dieses Experiment wurden bis zu 15 Proben automatisch im Kingfisher verarbeitet. Die Dihydropyrimidin-Dehydrogenase (DPD) ist das geschwindigkeitsbestimmende Enzym beim dreistufigen Abbau der Pyrimidinbasen Uracil und Thymin [1]. DPD ist außerdem das Schlüsselenzym, das den strukturell ähnlichen Pyrimidin-Antimetaboliten 5-Fluorouracil (5-FU) abbaut.

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Das Zytostatikum 5-FU wird bei vielen malignen Erkrankungen wie Darm-, Brust-, oder Eierstocktumoren therapeutisch genutzt [2]. Bei drei bis fünf Prozent der Bevölkerung tritt eine Unverträglichkeit gegenüber 5-FU auf [3]. Ursache der dadurch hervorgerufenen toxisch bedingten Störungen wie beispielsweise Diarrhöe, Stomatitis und neurologische Störungen ist eine erniedrigte Aktivität der DPD. Diese resultiert in einem verlangsamten physiologischen Abbau des 5-Fluorouracil. Normalerweise werden mehr als 80 Prozent des verabreichten 5-FU in kurzer Zeit metabolisiert. Bei Patienten mit erniedrigter DPD-Aktivität finden sich hingegen stark erhöhte 5-FU Plasmaspiegel [4]. Die Ursache für die niedrige DPD-Aktivität liegt in einer Mutation des DPD-kodierenden DPYD-Gens. Ein Mutationsscreening dieses Gens kann zeigen, ob es bei einem Patienten voraussichtlich zu einer Unverträglichkeit gegenüber 5-FU kommt. Dazu muss zunächst genomische DNA des Patienten isoliert werden. Herkömmliche Verfahren sind dabei häufig aufwändig und kostenintensiv. Das DNA-Isolierungsverfahren aus humanen Vollblutproben per Invitek-Kit stellt eine schnelle und kostengünstige Alternative dar. Die auf diese Weise isolierte genomische DNA konnte für das Mutationsscreening des DPYD-Gens zur Risikoabschätzung der 5-FU-Verträglichkeit bei einer Chemotherapie von Krebspatienten verwendet werden.

Mutationsscreening gibt Aufschluss

Die weitaus häufigste Mutation bei Patienten mit einer erniedrigten Gesamtaktivität der DPD ist die so genannte Exon-14-Skipping-Mutation [5].

Diese Mutation verursacht eine Deletion von 55 Aminosäuren in der Primärsequenz des DPD-Proteins und führt somit zu einem verkürzten und inaktiven Protein [4]. Auch heterozygote Mutationen haben eine erniedrigte DPD-Aktivität und 5-FU-Unverträglichkeit zur Folge [6]. Daher wird vor geplanter Chemotherapie mit 5-Fluorouracil eine Mutationsanalyse des DPYD-Gens durchgeführt. Bei heterozygoten Patienten wird die individuelle Pharmakogenetik ermittelt und eine reduzierte 5-FU-Dosis festgelegt. Bei homozygoten Mutationsträgern wird von einer Therapie mit 5-Fluorouracil abgesehen. Im Rahmen dieser Routineuntersuchung wurde eine semi-automatische Aufreinigung der DNA aus humanen Vollblutproben mithilfe des Thermo Scientific Kingfisher mL in Kombination mit dem Invitek Invimag-Kit realisiert. Im Vergleich zum Einsatz vollautomatischer Instrumente ermöglicht dieses System einen wichtigen Schritt hin zur kostengünstigen Standardisierung der bislang sehr arbeitsaufwändigen Isolierung von Nukleinsäuren im Labor.

DNA Aufreinigung aus Vollblutproben

Die Aufreinigung der genomischen DNA aus humanen Vollblutproben mithilfe des Invimag-Kits lässt sich innerhalb von 25 Minuten durchführen.

Die Blutproben stammen von Krebspatienten, die auf 5-FU-Unverträglichkeit vor einer geplanten Chemotherapie getestet werden sollen. Die Qualität der verwendeten Proben kann je nach Alter und Gesundheitszustand des Patienten sowie entsprechend verschiedener Lager- und Transportbedingungen der Proben stark schwanken.

Nach dem Mischen von 150 µl EDTA-stabilisiertem Vollblut (50 bis 200 µl frisches oder gefrorenes humanes bzw. Säugetierblut kann als Startmaterial verwendet werden) mit 200 µl Lysepuffer A und 20 µl Proteinase K werden sämtliche Proben für zehn Minuten bei 56 °C in einen Schüttel-inkubator (900 upm) gegeben. Dies soll die Aktivität der Proteinase bei der Lyse und dem Proteinverdau unterstützen. Während der Lyse ist für jede Probe ein Kingfisher-Röhrchenstreifen in die Probenhalterung einzusetzen. Anschließend werden die Röhrchenstreifen B bis E gemäß Tabelle 1 mit den mitgelieferten Puffern befüllt. Nach Abschluss der Lyse werden die Proben in die Kingfisher-Röhrchenstreifen übertragen (Röhrchen A). Es werden 400 µl Bindungslösung und 20 µl Magnetpartikellösung A hinzugefügt und mit jedem Lysat gemischt, um optimale Bindungsbedingungen herzustellen. Nach dem Befüllen der Röhrchenstreifen werden diese im Gerät platziert und die Kammspitzen eingesetzt. Die Frontabdeckung wird geschlossen und die Proben mit dem Reinigungsprotokoll verarbeitet.

Unter den eingestellten Bedingungen bindet die genomische DNA quantitativ an die Magnetpartikel. Anschließend werden die Magnetpartikel in die Waschpuffer 1 und 2 übertragen, um sämtliche Verunreinigungen wie Proteine, Nukleasen oder PCR-Inhibitoren zu entfernen. Nach dem Waschen wird das Ethanol von den Partikeln entfernt und die genomische DNA in Elutionspuffer D eluiert.

Nach Abschluss des Reinigungsprogramms werden die entstandenen Eluate zur weiteren Verwendung gelagert.

Ergebnisse der Detektion

Standardmäßig wird ein Aliquot von zwei Mikrolitern von jedem Eluat (1/50) zur Detektion der DPYD-Mutation verwendet. Die Methode der PCR-Detektion wurde im Labor der Zentralen Einrichtung für Molekulare Diagnostik des Städtischen Klinikums Braunschweig entwickelt und etabliert. Mithilfe von Schmelzkurven lassen sich die Allele unterscheiden.

Das beschriebene Extraktionsverfahren bietet eine effiziente Reinigung der genomischen DNA aus humanen Vollblutproben. Die Abbildung 2a zeigt die Amplifizierung des PCR-Produktes von Exon 14 des DPYD-Gens. Die rote Kurve zeigt das Amplifikationsprodukt der Patienten-DNA, die grüne Kurve zeigt das Amplifikationsprodukt der Kontroll-DNA einer heterozygoten Probe. Nach der Detektion (Abbildung 2a) misst das Lightcycler-Gerät die Schmelzkurve des amplifizierten Produktes. Abbildung 2b zeigt die erste Ableitung der Schmelzkurve. Weist diese zwei Maxima auf, wird eine heterozygote DPYD-Mutation detektiert. Die Patientenprobe (rote Kurve) zeigt keine DPYD-Mutation und der Patient kann folglich mit einer Standarddosis des Zytostatikums 5-FU behandelt werden.

Die Ergebnisse zeigen ein detailliertes Beispiel für eine typische Analyse der Exon-14-Skipping-Mutation, die routinemäßig in dem Labor der Zentralen Einrichtung für Molekulare Diagnostik am städtischen Klinikum Braunschweig verwendet wird.

Schlussfolgerung

Neue molekularbiologische Techniken ermöglichen eine Prognose der individuellen metabolischen Kapazität von Patienten. Diese Techniken müssen eine sehr hohe Effizienz und Sensitivität bei der Isolierung und Detektion von Nukleinsäuren aufweisen. Das beschriebene Verfahren entspricht diesen Kriterien in Bezug auf das Mutationsscreening des DPYD-Gens vor 5-FU-Chemotherapie bei Krebspatienten.

Das Invitek Invimag Blood DNA Mini Kit/KFmL bietet eine schnelle und kostengünstige Aufreinigung genomischer DNA aus Blutproben. In Kombination mit dem Thermo Scientific Kingfisher mL wurde es im Labor ebenfalls für andere diagnostische Screenings aus Blutproben eingesetzt, z.B. bei der Translokation bei Chromosom 8,14 oder der Detektion von B-Zelltumoren.

Literatur

[1] Wei X et al. Molecular basis of the human dihydropyrimidine dehydrogenase deficiency and 5-fluorouracil toxicity. J Clin Invest. 1996 Aug 1;98(3):610-5.

[2] Jézéquel P et al. Common DPYD Mutation Associated with 5-Fluorouracil Toxicity Detected by PCR-mediated Site-directed Mutagenesis. Clin Chem. 2000 Feb;46(2):309-10.

[3] Ezzeldin HH et al. Methylation of the DPYD promoter: an alternative mechanism for dihydropyrimidine dehydrogenase deficiency in cancer patients. Clin Cancer Res. 2005 Dec 15;11(24 Pt 1):8699-705.

[4] Raida M et al. Prevalence of a common point mutation in the dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD) gene within the 5‘-splice donor site of intron 14 in patients with severe 5-fluorouracil (5-FU)- related toxicity compared with controls. Clin Cancer Res. 2001 Sep;7(9):2832-9.

[5] Saif MW et al. DPYD*2A mutation: the most common mutation associated with DPD deficiency. Cancer Chemother Pharmacol. 2006 Dec 13; [Epub ahead of print]

[6] van Kuilenburg AB et al. Severe 5-fluorouracil toxicity caused by reduced dihydropyrimidine dehydrogenase activity due to heterozygosity for a G-->A point mutation. J Inherit Metab Dis. 1998 Jun;21(3):280-4.

*Dr. H. Hannig, Zentrale Einrichtung für Molekulare Diagnostik, Städtisches Klinikum Braunschweig GmbH, 38114 Braunschweig **S. Farhangi, Invitek GmbH, 13125 Berlin

***L. Kanto, Thermo Fisher Scientific, 01621 Vantaa/Finnland

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