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Vielfarben-Mikroskopie

Neue Mikroskopie bringt Farbe in die biomedizinischen Forschung

| Autor/ Redakteur: Anna Löschberger* / Dr. Ilka Ottleben

Bereits seit einem halben Jahrhundert erlaubt die Fluoreszenzmikroskopie die spezifische Darstellung zellulärer Strukturen und Gewebe. Würzburger Forscher haben nun eine Methode entwickelt, mit der sich neun und mehr verschiedene Zellstrukturen gleichzeitig markieren und abbilden lassen.

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Abb. 2: Drei verschiedene Sonden (Phalloidin, Azid und Antikörper) wurden mit demselben Fluoreszenzfarbstoff (ATTO 488) markiert, wodurch drei Zellstrukturen sichtbar gemacht werden konnten: Das Aktin-Zellskelett (grün), die DNA im Zellkern (blau) und der so genannte Golgi-Apparat (magenta). Dieses Ergebnis hebt die extrem hohe Sensitivität des sFLIM-Verfahrens hervor.
Abb. 2: Drei verschiedene Sonden (Phalloidin, Azid und Antikörper) wurden mit demselben Fluoreszenzfarbstoff (ATTO 488) markiert, wodurch drei Zellstrukturen sichtbar gemacht werden konnten: Das Aktin-Zellskelett (grün), die DNA im Zellkern (blau) und der so genannte Golgi-Apparat (magenta). Dieses Ergebnis hebt die extrem hohe Sensitivität des sFLIM-Verfahrens hervor.
(Bild: modifiziert nach Niehörster et al., Nature Methods 2016 [1])

Der Lehrstuhl für Biotechnologie und Biophysik der Universität Würzburg hat eine Methode entwickelt, mit der sich neun verschiedene Zellstrukturen gleichzeitig markieren und abbilden lassen. Theoretisch sind sogar fünfzehn Markierungen oder mehr möglich. Die Voraussetzung hierfür ist eine äußerst präzise Zuordnung von Fluoreszenz-Signalen, welche die Forscher nun mittels spektral aufgelöster Fluoreszenz-Lebensdauer-Mikroskopie (sFLIM) erreichen.

Was ein Fluoreszenzmikroskop detektiert

Schon lange gehört die Fluoreszenzmikroskopie zu den gebräuchlichsten bildgebenden Verfahren in der biologischen Forschung. Um bestimmte Substrukturen in einzelnen Zellen oder spezielle Bereiche von Geweben bildlich darzustellen, werden mit Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelte Marker verwendet. Diese Sonden bleiben dann z.B. an Proteinen, Fetten oder der DNA haften und können mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops abgebildet werden. Für den Biologen werden dadurch verborgene Strukturen, wie z.B. das formgebende Zellskelett, die Hülle des Zellkerns oder Bereiche neu entstehender DNA sichtbar.

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Bei Fluoreszenzmikroskopie denken die meisten automatisch an die klassische Fluoreszenzmikroskopie, bei der die Fluoreszenzintensität gemessen und Farbstoffe spektral (nach Farben) voneinander getrennt werden. Je nach Mikroskop-Ausstattung lassen sich damit Ein- oder Mehrfarben-Experimente durchführen, wodurch eine entsprechende Anzahl an Strukturen in einer Zelle oder einem Gewebeschnitt dargestellt werden kann. „Eine Schwierigkeit ist die eindeutige Unterscheidung von vielen verschiedenen fluoreszierenden Sonden, wenn sie sich teilweise sehr ähnlich sind“, sagt Thomas Niehörster, Doktorand bei Professor Sauer am Würzburger Biotechnologie-Lehrstuhl. Die Menge an möglichen Farben ist dadurch begrenzt und beeinflusst auch die Komplexität und die Kosten des Mikroskops.

Eine andere Fluoreszenz-Eigenschaft macht sich die Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (FLIM) zu nutze. Hierbei werden Fluoreszenzfarbstoffe nicht anhand ihrer unterschiedlichen Emissionsspektren (Farben), sondern anhand ihrer charakteristischen Fluoreszenzlebensdauer unterschieden (s. LP-Info).

Ergänzendes zum Thema
LP-Info: Von Farbstoffen und Lebensdauern

Werden Fluoreszenzfarbstoffe mit Licht angeregt, fluoreszieren sie, das heißt sie geben nun selbst Photonen (Licht) einer bestimmten Wellenlänge ab. Diese Emission von Licht ist ein gutes Unterscheidungsmerkmal dieser Farbstoffe, da sie eine spektrale (farbliche) Auftrennung ermöglicht. Als Fluoreszenzlebensdauer eines Farbstoffs bezeichnet man die mittlere Zeit, die er nach der Anregung auf einem höheren Energieniveau verbleibt, bevor er unter Abgabe eines Photons wieder in den Grundzustand zurückkehrt.

Das Unternehmen Picoquant, mit dem die Würzburger Forscher regelmäßig in Projekten kooperieren, ist auf zeitauflösende Methoden wie FLIM spezialisiert.

sFLIM nutzt Spektrum und Lebensdauer von Farbstoffen

Um möglichst viele Moleküle markieren und unterscheiden zu können, kombinieren die Wissenschaftler in ihrem neuen Verfahren nun die spektrale Fluoreszenzmikroskopie mit der Messung von Fluoreszenzlebensdauern. Die so genannte spektral aufgelöste Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (sFLIM) vereint hierbei die Vorteile beider Techniken und überwindet gleichzeitig Nachteile herkömmlicher Systeme hinsichtlich Empfindlichkeit, Geschwindigkeit und Auflösung. Zur Anregung der fluoreszenzmarkierten Sonden verwenden die Wissenschaftler drei abwechselnd gepulste Laser mit verschiedenen Wellenlängen (blau, grün, rot). Neben Unterschieden im Emissionsspektrum bestimmen sie mithilfe eines speziellen Detektors gleichzeitig die Fluoreszenz-Lebensdauer der Farbstoffe, die sich im Bereich von wenigen Nanosekunden bewegt. „Für jeden Farbstoff ergibt sich somit ein Pattern, also eine Art spezifisches Eigenschaftsmuster, wodurch er sich eindeutig von anderen Farbstoffen abgrenzt“, erklärt Niehörster. Den Forschern gelang es, je Laser fünf Fluoreszenzsonden zu unterscheiden, sodass theoretisch 15 Ziele gleichzeitig darstellbar wären. Der limitierende Faktor war letztlich nicht mehr die Auswahl an Farbstoffen, sondern die Verfügbarkeit an biologischen Sonden. Unter diesen Umständen gelang eine Aufnahme mit neun Farben, bei welcher unterschiedliche Zellstrukturen markiert wurden (s. Abb. 1).

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