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SCHADSTOFF-ANALYSE Optimierte GC-Trennungen in der Mykotoxinanalytik

Autor / Redakteur: WOLFGANG BRODACZ* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Schimmelpilze richten weltweit nicht nur großen wirtschaftlichen Schaden an, sie gefährden auch mit ihren teils hochtoxischen Mykotoxinen (sekundäre Stoffwechselprodukte) die Ernährung und Gesundheit von Konsumenten und Nutztieren

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( Archiv: Vogel Business Media )

Schimmelpilze richten weltweit nicht nur großen wirtschaftlichen Schaden an, sie gefährden auch mit ihren teils hochtoxischen Mykotoxinen (sekundäre Stoffwechselprodukte) die Ernährung und Gesundheit von Konsumenten und Nutztieren. Am Beispiel der in Europa besonders bedeutenden Trichothecen-Mykotoxine wird gezeigt, dass die Gaschromatographie mit ihrer hohen Trennleistung und sehr empfindlichen Detektion gut geeignet ist, die Vielfalt der Zielanalyten routinetauglich und sicher nachzuweisen. Bei der Methodenentwicklung wurde auch eine neue polare GC-Phase (Arylen-Technologie der zweiten Generation) und die computergestützte GC-Simulation eingesetzt.

Die wichtigsten Trichothecene werden in die Gruppen A und B unterteilt, wobei sich die B-Trichothecene durch eine Carbonyl-Gruppe in C-8 vom Typ A unterscheiden. Eine Reihe von HPLC-Methoden zielt nur auf Deoxynivalenol als Leitsubstanz ab und oft sind dafür komplexe Vorreinigungen notwendig. A-Trichothecene zeigen bei UV-Detektion zudem keine brauchbare Absorption [1]. Die GC kann mit Standarddetektoren praktisch alle derivatisierten Trichothecene empfindlich nachweisen. Insbesondere bei schwierigen Matrizes gelingt oft nur dank der hohen Trennleistung der Kapillar-GC eine sichere Quantifizierung. Die bis zu vier freien OH-Gruppen der Trichothecene müssen vor der Gaschromatographie durch Derivatisierung substituiert werden. Während die silylierten B-Trichothecene eine strukturbedingte ECD-Empfindlichkeit besitzen, ist es für die A-Gruppe zweckmäßig, durch Derivatisierung mit HFBI fluorierte Gruppen einzufügen, die die Ansprechempfindlichkeit des ECD verstärken.

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Der zusätzliche Aufwand für die notwendige Derivatisierung wird bei der GC-Bestimmung durch die sehr hohe Nachweisempfindlichkeit und Auflösung kompensiert. Ein wenig beachteter Vorteil dabei ist, dass auch viele polare Matrixbestandteile zu flüchtigen Derivaten umgesetzt werden und, ohne Injektor und Säule dauerhaft zu verunreinigen, das System „auf chromatographischem Wege“ verlassen. Bei der Entwicklung einer abgesicherten GC-Methode sind, abgesehen von hoher Nachweisstärke, die mittels kostengünstigem ECD erreicht wird, nachfolgende Anforderungen maßgeblich. An erster Stelle steht die optimale Auftrennung aller Zielanalyten, sowohl bei den silylierten B-Trichothecenen Deoxynivalenol (DON), Nivalenol (NIV), Fusarenon X (Fus X), 3-Acetyldeoxynivalenol (3-AcDON) und 15-Acetyldeoxynivalenol (15-AcDON), als auch bei den „halogenierten“ A-Trichothecenen T-2 Toxin, HT-2 Toxin, 15-Monoacetoxyscirpenol (MAS) und Diacetoxyscirpenol (DAS).

Die Absicherung auf einer zweiten Säule möglichst unterschiedlicher Polarität ist die andere wichtige Zielvorgabe. Darüber hinaus wird eine Referenzsubstanz eingebunden, welche die Feinjustierung der Peak-Erkennungsfenster erlaubt und eine Kontrolle des ECD-Response bei jedem GC-Lauf gewährleistet. Mit der Verwendung des chlorierten InsektizidsMirex ist diese Qualitätssicherungsmaßnahme bereits seit geraumer Zeit erfolgreich in die Praxis umgesetzt.

Methodenentwicklung

Am Beginn der Methodenentwicklung wurde die GC/MS zur Kontrolle der vollständigen Derivatisierung aller OH-Gruppen und Absicherung der Identität eingesetzt. Mittels Computersimulation konnten die Peak-Positionen für die GC/ECD-Routinesysteme exakt vorausberechnet werden [2].

Computersimulation

Zur Optimierung der GC-Methoden wird die computergestützte Trennungsoptimierung auf Basis der so genannten „thermodynamischen Retentionsindizes“ (TRI) eingesetzt. Sie beschreiben das chromatographische Verhalten jedes Analyten auf einer bestimmten stationären Phase und sind unabhängig von der Säulengeometrie und den pneumatischen Parametern. Für ihre Berechnung sind lediglich zwei Kalibrierchromatogramme mit unterschiedlichen Temperaturprogrammen notwendig [3]. Mit Hilfe der TRI können für jede beliebige Trennbedingung auf Knopfdruck Retentionszeiten und Halbwertsbreiten jedes Analyten simuliert werden.

Daraus berechnete Auflösungsinformationen bzw. die optische Beurteilung der simulierten Chromatogramme ermöglichen eine rasche Erfolgskontrolle der jeweiligen Vorgaben. Durch wiederholte Variation der Temperaturprogramme (mehrere Millionen pro Tag) wird der optimale Temperaturverlauf (max. Auflösung bei min. Analysenzeit) ermittelt. Darüber hinaus ist es möglich Variationen von Länge, Innendurchmesser, Filmdicke und Gasfluss wiederum mit Millionen von Temperaturprogrammen zu kombinieren. Am Ende einer kompletten Trennungsoptimierung steht für eine bestimmte stationäre Phase die ideale Geometrie der Kapillare und das jeweils optimale Temperaturprogramm sowohl für die A- als auch für die B-Trichothecene fest.

Belastbare polare Phase

Nach Optimierung aller Trennparameter mit dem gängigsten unpolaren Phasentyp Methyl-Polysiloxan (MPS) mit 5% Phenylanteil folgt die Auswahl polarerer Phasen zur Absicherung. Grundsätzlich kommt MPS das mit Phenyl- bzw. Cyanopropyl-Gruppen modifiziert ist, für die Trichothecen-Analytik in Frage. Neben der Erhöhung des Phenylanteils auf 35% stehen noch die Phasentypen 1301 und 1701 zur Verfügung, die Anteile von 6 bzw. 14% an Cyanopropyl/Phenyl-Substituenten enthalten. Während sich unpolare MPS-Phasen wie z.B. HP-1(ms), DB-1(ms), HP-5(ms), DB-5(ms) durch sehr hohe thermische Belastbarkeit (325°C isotherm) und besondere Inertheit auszeichnen, ist bzw. war die Situation bei (mittel)polaren Säulen weniger erfreulich.

Cyanopropyl-Phasen sind auf Dauer meist nur bis 280°C einsetzbar und zeigen insbesondere am sehr empfindlichen ECD erhöhtes Bluten. Weiterentwicklungen in der Polymerchemie haben zur Arylen-Technologie der zweiten Generation geführt. Diese wurde auch bei polareren Phasen implementiert, sodass z.B. mit der DB-35ms von Agilent eine thermisch hoch belastbare Säule zur Verfügung steht [4]. Mit einer Maximaltemperatur von 340/360°C (isoth./ progr.), sehr inerten Eigenschaften und minimalem Bluten am ECD bietet sich diese Phase als Erfolg versprechender polarer „Partner“ nicht nur für die Trichothecen-Absicherung an.

Mit den drei polareren Phasen werden - in Analogie zur unpolaren Variante - für alle Zielanalyten die jeweiligen TRIs berechnet und nach Trichothecen-Typ getrennt, jeweils umfangreiche Trennungsoptimierungen (mehrere Millionen Varianten) durchgeführt. Letztlich stehen sowohl für die A- als auch für die B-Trichothecene die jeweils optimierten Trennbedingungen für alle vier Phasentypen zur Verfügung.

Aus diesen Daten erfolgt abschießend die Auswahl der zwei am besten geeigneten und sich komplementär ergänzenden Trennungen. Die Hauptkriterien für die Auswahl als Absicherungskombination sind vollständige Auftrennung aller Zielanalyten und möglichst unterschiedliche Elutionsmuster der beiden Phasen. Je unterschiedlicher das Elutionsverhalten, desto größer die Identifizierungssicherheit. Schließlich nimmt die Wahrscheinlichkeit, dass es auf beiden Säulen zu einer Koelution eines Zielanalyten mit derselben Verunreinigung kommt, deutlich ab, je stärker sich die chromatographischen Eigenschaften der zwei Phasen unterscheiden [5].

Optimierte Trennung mit Zeitvorteil

Hinsichtlich Auftrennung und Verifizierung werden die besten Ergebnisse bei der Kombination der DB-35ms mit der unpolaren Phase mit 5% Phenyl erzielt. Die optimierten Auftrennungen der fünf B-Trichothecene in Form ihrer TMS-Derivate sind in Abbildung 1 gegenübergestellt. Mit der DB-35ms konnte trotz vollständiger Auflösung aller Analyten die Analysenzeit verglichen mit der unpolaren Phase nahezu halbiert werden. Während jeweils DON am Anfang und die Referenzsubstanz Mirex am Ende eluieren, sind die relativen Positionen der übrigen vier B-Trichothecene völlig unterschiedlich (Nivalenol z.B. eluiert auf der polaren Säule an zweiter Stelle und auf der unpolaren als vorletzter Peak). Ebenfalls große Elutionsunterschiede konnten bei der vergleichenden Auftrennung der vier A-Trichothecene als HFB-Derivate in Abb. 2 erzielt werden.

Zusätzlich ist dabei auch sichergestellt, dass ihre Bestimmung nicht durch die Anwesenheit von B-Trichothecenen gestört wird, welche ebenfalls HFB-Derivate bilden. Mit der DB-35ms ist es sogar möglich die Trennbedingungen so zu optimieren, dass sowohl die vier A-Trichothecene als auch die fünf B-Trichothecene - gemeinsam silyliert - in einem GC-Lauf innerhalb von 25 Minuten aufgelöst werden (Abb. 3). Aufgrund des um rund eine Zehnerpotenz geringeren ECD-Response der A-Typen ist eine gemeinsame Bestimmung aller Trichothecene als TMS-Derivate allerdings nur für Screening-Zwecke sinnvoll. Obwohl es technische möglich ist, beide Säulen an einem Injektor angeschlossen in einem GC mit zwei ECDs zu betreiben, muss doch die Variante mit zwei unabhängigen GCs dringend empfohlen werden. Nur so kann kompromisslos das jeweils optimale Temperaturprogramm eingesetzt und unterschiedliche Säulendimensionen verwendet werden.

Es sind zwei unabhängige Injektionen gewährleistet, wodurch eventuell auftretende Probleme bei der Probenaufgabe (sog. „Matrixerhöhung“) sofort erkannt werden [6]. Damit der Begriff „Proben-Aufgabe“ nicht wörtlich genommen werden muss, ist auf eine möglichst hohe Inertheit des Injektionssystems zu achten. Kurze Nadelverweilzeiten durch schnell injizierende Sampler, silanisierte Glaswolle im inerten Quarz-Liner und die Vermeidung von freien Stahloberflächen durch sog. „Gold Plated Seals“ schützen die Trichothecene vor Zersetzung und Adsorption im Splitless-Injektor (Abb. 4).

Fazit

Im Vergleich zur HPLC erlaubt die hohe Trennleistung von GC-Kapillaren in Kombination mit sehr empfindlichen Detektoren (ECD, MSD) die simultane und nachweisstarke Bestimmung vieler Trichothecene in einem Chromatographieschritt. Durch die Verwendung der Referenzsubstanz Mirex wird mittels Retentionszeit-Feinanpassung die Peakerkennung wesentlich verbessert und das gesamte chromatographische System inklusive Detektor bei jedem Lauf auf Reproduzierbarkeit überprüft.

Darüber hinaus gewährleistet insbesondere der parallele Einsatz von zwei Kapillaren unterschiedlicher Säulenpolarität und computergestützt optimierter Trennparameter höchste Identifizierungssicherheit. Durch die hohe thermische Belastbarkeit bei gleichzeitig sehr guter Inertheit und minimaler Blutungsneigung der DB-35ms, steht auch eine ideale polare Phase zur Verfügung. Sie kann nicht nur zur Verifizierung gut mit unpolaren Phasen kombiniert werden, sondern darf dank der schnelleren Auftrennung sogar als erste Wahl für Screening-Aufgaben gelten.

ALLGEMEINE GC-PARAMETER FÜR ABBILDUNGEN 1–3

- GC: 2 Stk. Agilent HP5890 mit Splitless-Injektoren und Electron-Capture-Detektoren- Autosampler: Agilent 6890-Injektor (mit kurzer Nadelverweilzeit)- Injektor: 250 °C; inerte Verdampfungskammer durch silanisierte Glaswolle, „Single Tapered Liner“ u. „Gold Plated Seal“- Injektionsvolumen: 3 µl der iso- Oktan-Lösung (bei A-Tr. mit 10% Toluol)- Injektionsmodus: Splitless mit 2 min „Purge Time“- Trägergas: He „Constant Pressure” (30 m: 125 kPa / 50 m: 200 kPa)- Temperatur-Prog.: 3-stufig von 80 °C bis isoth. Temperaturlimit (Verlauf je nach Phase und Trichothecen Typ mit Computersimulation optimiert)- Detektor: ECD bei 330/340 °C (Make up: 90 ml Stickstoff /min) Detail-Infos: @ wolfgang.brodacz@ages.at

Literatur[1] Krska R., Baumgartner S., Josephs R.; „The state-of-the-art in the analysis of type-A and -B trichothecene mycotoxins in cereals“; Fresenius J. Anal Chem; 371; 285-299; 2001[2] W. Brodacz, „Computersimulation für den Transfer von GC-Methoden Teil 1“, Labor- Praxis, S84-91, Februar 1997 und „Computersimulation für den Transfer von GC-Methoden Teil 2“, LaborPraxis, S46-49, März 1997[3] W. Brodacz, „Trennungsoptimierung in der Kapillar-GC 1. Teil: Temperaturprogramm und GC-Simulation“; LaborPraxis, S48-52, Februar 1996 und „Trennungsoptimierung in der Kapillar-GC 2. Teil: GC-Simulation und Optimierungsstrategien in der Praxis“; LaborPraxis, S46-54, März 1996.[4] W. Brodacz, „Vergleich und Kombination von GC-Phasen“ , LaborPraxis LP 4, S48-53, April 2004[5]W. Brodacz, „Verifizierungsstrategien in der GC-Rückstandsanalytik“; LaborPraxis LP3, S 36 - 39; März 2003[6] Pettersson H., “Intercomparison of Trichothecene analysis and feasibility to produce certified calibrants and referencematerial”, (Progress report) EU Report EN 18214, BCR Information 1-164, 1998

*W. Brodacz, AGES Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit GmbH

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