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Arrays Peptidchips aus dem Drucker

Autor / Redakteur: Thomas Felgenhauer*, Simon Fernandez*, Klaus Leibe*, Volker Stadler*, Ralf Bischoff*, Frank Breitlin / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Die Aufklärung infektionsbedingter Immunreaktionen kann durch den Einsatz hochkomplexer Molekülbibliotheken und Arrays auf Peptidbasis enorm vereinfacht werden. Das Gleiche gilt für die Suche nach diagnostischen Markern oder therapeutischen Wirkstoffen.

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Abb. 1 Schema des Laserdruck- und Kopplungsvorgangs in Tonerpartikel eingebetteter Fmoc-Aminosäure-OPfp Ester. Wiederholte Kopplungszyklen ergeben einen Peptidarray.
Abb. 1 Schema des Laserdruck- und Kopplungsvorgangs in Tonerpartikel eingebetteter Fmoc-Aminosäure-OPfp Ester. Wiederholte Kopplungszyklen ergeben einen Peptidarray.
( Archiv: Vogel Business Media )

Hochkomplexe Molekülbibliotheken und Arrays auf Peptidbasis können bei der Aufklärung infektionsbedingter Immunreaktionen sowie der Suche nach diagnostischen Markern oder therapeutischen Wirkstoffen helfen. Könnte man Peptidarrays in einer Komplexität fertigen, die es ermöglicht, z.B. komplette Genome von Krankheitserregern in überlappende Peptide zu übersetzen, würde die Diagnostik deutlich vereinfacht und beschleunigt. Für den Arzt wäre es dann beispielsweise einfacher, im Patientenblut nach krankheitsspezifischen Antikörpern zu suchen. Mit einer neuen, Laserdrucker-basierten Technik lassen sich Peptidchips in bislang nicht erreichter Komplexität produzieren [1].

Im Bereich der DNA-Chips werden mit lithographischen Methoden mittlerweile Arrays mit tausenden von Oligonukleotiden pro cm2 hergestellt [7]. Nachteil dieser Techniken ist, dass immer nur ein Monomer pro Arbeitsschritt an den Träger gekoppelt werden kann. Deswegen würden 20 x 10 Kopplungszyklen benötigt, um einen Array mit Peptiden von jeweils zehn Aminosäuren Länge herzustellen. Aufgrund dieses peptidspezifischen Nachteils ist es schwierig, mittels lithographischer Methoden Arrays mit längeren Peptiden herzustellen [8]. Die Arbeitsgruppe „Chipbasierte Peptidbibliotheken“ am Deutschen Krebsforschungszentrum hat sich jetzt gemeinsam mit dem Fraunhofer Institut für Produktionstechnik und Automatisierung dieses Problems angenommen und einen neuen Laserdrucker-basierten Ansatz entwickelt. Damit wird die schnelle, flexible und preisgünstige Herstellung entsprechender Arrays möglich.

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Synthese der Peptidchips mittels Laserdruck

Ein zum „Peptiddrucker“ umfunktionierter Laserdrucker dient dabei als Synthesemaschine: die 20 unterschiedlichen Aminosäuren werden in Form von festen Aminosäure-Tonern ortsgenau auf einen Glasträger gedruckt. Anschließend wird der Träger dem Drucker entnommen und in Schutzgasatmosphäre auf 90 °C erhitzt. Der so initiierte Schmelzvorgang führt in jedem Spot letztlich zur Reaktion der Aminosäurederivate mit freien Aminogruppen auf dem Träger. Die dort schon vorhandenen Peptide verlängern sich damit um exakt eine Einheit. Schaltet man zwischen die aufeinander folgenden Druckvorgänge die in der Merrifield-Synthese üblichen Wasch- und Entschützungsschritte, so gelangt man auf einfachem Wege zu einem vollständig kombinatorisch synthetisierten Peptidarray (s. Abb. 1). Bei diesem Prozess kommt die herkömmliche Fmoc-Chemie [9] zum Einsatz. Die Methode unterscheidet sich von der Standard Festphasensynthese nur durch das bei Raumtemperatur „feste“ Lösungsmittel.

Entwicklung des Peptiddruckers

Der Peptiddrucker basiert auf einem herkömmlichen Farblaserdrucker der Firma OKI. Die im normalen Office-Betrieb üblichen vier Druckwerke (schwarz, magenta, cyan, gelb) wurden auf 20 Druckwerke erweitert, um jeweils einen der 20 speziellen Aminosäure-Toner aufzunehmen. Die Druckmaschine (s. Abb. 2a) positioniert die zu bedruckende Glasplatte (den späteren Array) auf ± 5 µm. Diese Präzision gewährleistet, dass die unterschiedlichen Druckschichten exakt übereinander liegen.

Die dem Peptiddrucker zugrunde liegenden OKI-Druckeinheiten besitzen jeweils eine etwa 20 cm breite Zeile mit ~10 000 Licht emittierenden Dioden (LEDs) (s. Abb. 2b), die für das bildgebende Lichtmuster auf der Oberfläche einer OPC-Walze (organic photo conductor; organischer Photoleiter) verantwortlich ist [10]. Aus der Anzahl der LEDs in einer Zeile und der Anzahl der Belichtungsschritte der OPC-Walze pro Umdrehung ergibt sich ein maximales Auflösungsvermögen von etwa 100 Millionen Pixel pro (20 x 20) cm2. In der Praxis liefert der im DKFZ genutzte Drucker-Prototyp derzeit ca. 160 000 Aminosäurespots pro (20 x 20) cm2 (s. Abb. 2c). Weiterentwicklungen dieses Prototyps und der zugehörigen Steuerungssoftware sollen in naher Zukunft bereits 500 000 bis 1 Million Spots möglich machen.

Aminosäure-Tonerpartikel

Die Aminosäure-Tonerpartikel müssen einerseits in ihrer Zusammensetzung mit der Peptidchemie vereinbar sein und andererseits den physikalischen Anforderungen des Druckprozesses genügen. Die physikalischen Eigenschaften der speziell für diese Anwendung im DKFZ entwickelten Aminosäure-Tonerpartikel entsprechen weitgehend denen kommerziell erhältlicher Farbtoner. Die Größenverteilung der Partikel (s. Abb. 3, links) wurde mittels Laserbeugung bestimmt, das Schmelzverhalten der Partikel mit DSC (Differential Scanning Caloriemetrie) ermittelt und die Morphologie (s. Abb. 3, rechts) mittels eines REM (Raster Elektronen Mikroskop) überprüft. Als aktivierte Aminosäure-Derivate für die Peptidsynthese wurden die 20 verschiedenen Fmoc-Aminosäure-OPfp Ester (Fmoc = Fluorenylmethoxycarbonyl; OPfp = Pentafluorophenyl) gewählt, da diese voraktiviert, relativ stabil und außerdem kommerziell erhältlich sind. Weiterhin enthalten die Partikel eine Harzkomponente, ladungsgebende- und stabilisierende Agentien sowie ein bei Raumtemperatur festes Lösungsmittel, welches üblicherweise ein höheres Homologes der in der Peptidchemie gängigen Lösungsmittel (z.B. DMF vs. DPF, DMSO vs. DPSO) ist. Schmelzen die gedruckten Partikel bei 90 °C werden die eingeschlossenen Aminosäuren beweglich und können an die funktionalisierten Glasträger koppeln (s. Abb. 2c).

Der Träger – Funktionalisierte Gläser

Die Glasoberflächen werden für die Peptidsynthese mit einer speziellen Polymerschicht versehen, die kovalent verankert ist und durch Polymerisation von PEGMA-(Polyethylenglykolmethacrylat)-Einheiten hergestellt wird [11]. Durch die Derivatisierung dieser Schichten mit Aminogruppen entsteht ein weit verzweigtes Netzwerk, das sich durch eine hohe Dichte an Syntheseorten (ca. 10 – 20 nmol/cm2) und chemische Stabilität auszeichnet. Weiteres Merkmal dieser Schichten ist die Unterdrückung unspezifischer Wechselwirkungen der Arrayoberfläche mit Fremdproteinen in den späteren Anwendungen (Immunoassays). So kann auf herkömmliche Blockierungsagentien verzichtet werden. Das dadurch beträchtlich erhöhte Signal-Rausch-Verhältnis erleichtert das Auslesen von Bindungsereignissen.

Verifizierung der Methode

Um die vollkommen neue Synthesestrategie abzusichern und mit herkömmlichen Methoden in der SPSS (Solid Phase Peptide Synthesis) vergleichen zu können, wurde eine Vielzahl von Experimenten durchgeführt. Über die partikelbasierte Synthese von HA- und Flag-Epitopen ließ sich z.B. eine durchschnittliche repetitive Ausbeute von 90 Prozent ermitteln. Dieser Wert liegt zwar etwas unter den in der SPSS üblichen >95 Prozent, lässt sich aber auf die nicht vorquellbaren Syntheseschichten zurückführen. Die Integrität der synthetisierten Epitope wurde mittels HPLC und massenspektrometrischer Analyse eindeutig nachgewiesen (s. Abb. 4).

Weiterhin konnte durch Einsatz von HPLC-Analytik exemplarisch ausgeschlossen werden, dass die zur Kopplung verwendete Temperatur von etwa 90 °C zu einer Razemisierung der L-Aminosäuren führt. Eine weitere Untersuchungsreihe zeigte, dass keiner der in die Tonerpartikel eingeschlossenen Fmoc-Aminosäure-OPfp Ester einen messbaren Zerfall bei 25 °C aufwies. Die Ausnahme bildete hier das Arginin, welches aber lediglich mit fünf Prozent pro Monat zerfällt. Dies ist ein sehr bemerkenswertes Ergebnis, da carboxyterminal aktivierte Fmoc-Arginin-Derivate in anderen Lösungsmitteln extrem instabil sind [12].

Gelungene Tests

In einer der ersten Testanwendungen wurde auf einem Glasobjektträger (2,6 cm × 7,6 cm) ein Peptidarray mit 5500 verschiedenen Varianten der Flag-, HA- und Myc-Epitope synthetisiert. Nach Immunfärbung mit den entsprechenden Antikörpern ergab sich ein Färbemuster, das in seinen relativen Färbeintensitäten den Literaturwerten entspricht (s. Abb. 5), [13].

Arrays von Peptiden, die sich aus den in der Natur vorherrschenden L-Aminosäuren zusammensetzen, können generell für die Proteomforschung bzw. für diagnostische Zwecke (z.B. Erstellen von Antikörperprofilen) eingesetzt werden. In einer Beispielanwendung wird in Kooperation mit der Universität des Saarlandes nach Peptiden gesucht, die von SEREX-Antikörpern gebunden werden und später vielleicht zur Tumordiagnostik herangezogen werden können.

Für die Suche nach therapeutischen Wirkstoffen ist es hingegen sinnvoller, auch nicht-natürliche D-Aminosäuren (Spiegelbilder der L-Aminosäuren) in die Peptide einzubauen. Diese erhöhen die metabolische Stabilität und somit die Verweil- und Wirkdauer der Peptide im Körper. Da bei D-Peptiden nicht auf Genom- und Proteomdaten zurückgegriffen werden kann, ergeben sich nahezu unzählige Kombinationsmöglichkeiten der 20 Aminosäuren. Hier sind immer komplexere Peptidarrays gefragt, um einen immer größer werdenden Ausschnitt dieser Vielfalt abzubilden. Mit den 160 000 Peptidspots, die momentan pro Array erreicht werden können, wird dabei auf einen iterativen Suchansatz gesetzt. Hierbei werden in einer ersten Screening-runde peptidische Binder für ein bestimmtes Zielprotein (Target) gesucht. In einer zweiten Runde werden dann einzelne Aminosäurepositionen in den aufgefundenen Kandidaten ausgetauscht. Anschließend wird geprüft, welche Modifikationen zu einer Erhöhung der Affinität für das Target geführt haben. Die affinitätsgereiften Peptide sind interessante Wirkstoffkandidaten, die im Vorfeld klinischer Phasen weiter charakterisiert werden.

Eine Variante der hier beschriebenen Druck-Methode ist die Peptidsynthese auf einem Mikrochip. Hier werden die Aminosäure-Partikel direkt auf den Pixelelektroden des Chips abgeschieden, auf denen auch die Peptidsynthese und später die Proteinanalyse erfolgt [14]. Derzeit ermöglicht diese Technik allerdings nur eine beschränkte Kombinatorik. Sie ist aber durch die deutlich höhere Komplexität (über 40 000 Peptidelektroden/cm2) sehr zukunftsträchtig.

Hintergrund: Ein halbes Jahrhundert kombinatorische Peptidsynthese

Bruce Merrifield benutzte vor mehr als 40 Jahren zum ersten Mal einen festen Träger, um Aminosäuren nacheinander an eine wachsende Peptidkette zu koppeln [2]. Aus diesem Ansatz entwickelte sich im Laufe der Jahre die kombinatorische Peptidsynthese, wobei die unterschiedlichsten Methoden eingesetzt wurden, um eine möglichst große Zahl von Peptiden parallel zu synthetisieren und zu analysieren [3]. Mit der one-bead-one-compound-Methode [4] beispielsweise können auf einfache Weise sehr viele unterschiedliche Peptide hergestellt werden. Die Dekodierung der Peptide, die an ein Zielprotein binden, benötigt allerdings einen extrem hohen Arbeitsaufwand und beschränkt die Komplexität der eingesetzten Peptidbibliotheken. Auch können bei dieser Methode problematische Aminosäuresequenzen (z.B. unlösliche Peptide) nicht einfach ausgeschlossen werden, da technisch bedingt immer das gesamte kombinatorisch mögliche Peptidrepertoire hergestellt werden muss. Arrays haben diese Nachteile nicht. Durch die Position auf dem Array ist auch die Sequenz jedes Peptides bekannt, sodass problematische Peptidsequenzen, die z.B. ein unspezifisches Bindungsverhalten zeigen, in nachfolgenden Synthesen einfach ausgeschlossen werden können.

Peptidarrays wurden von Ronald Frank erstmalig mit Hilfe der von ihm entwickelten SPOT-Synthese hergestellt [5]. Diese auf dem Ink-Jet-Prinzip basierende Technik ist aufgrund ihrer Zuverlässigkeit und der vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten zwar immer noch dominant in der Arrayherstellung, wird aber durch die Nachteile der Flüssigsynthese limitiert, z.B. in Lösung instabile Aminosäurederivate, große Spot-Durchmesser, Verlaufen der Reaktionslösungen und Verstopfen der Düsen. Hohe Peptidspotdichten werden bei dieser Technik mit der SC2-Methode erreicht [6], wobei individuelle Peptide zunächst auf einem Zelluloseträger synthetisiert und dann in hoher Dichte auf Glasobjektträger gespottet werden. Diese Variante der SPOT-Synthese ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn viele identische Kopien eines hochdichten Peptidarrays hergestellt werden sollen.

Literatur:

[1] V. Stadler,* T. Felgenhauer,* M. Beyer, S. Fernandez, K. Leibe, S. Güttler, M. Gröning, K. König, G. Torralba, M. Hausmann, V. Lindenstruth, A. Nesterov, I. Block, R. Pipkorn, A. Poustka, F.R. Bischoff,* F. Breitling,* „Combinatorial Synthesis of Peptide Arrays with a Laser Printer“, Angewandte Chemie International Edition, in press 2008

[2] R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149–2154

[3] a) R. A. Houghten, C. Pinilla, S. E. Blondelle, J. R. Appel, C. T. Dooley, J. H. Cuervo, Nature 1991, 354, 84–86; b) U. Reineke, R. Volkmer-Engert, J. Schneider-Mergener, Curr. Opin. Biotechnol. 2001, 12, 59–64; c) H. M. Geysen, R. H. Meloen, S. J. Barteling, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1984, 81, 3998–4002.

[4] K. S. Lam, S. E. Salmon, E. M. Hersh, V. J. Hruby, W. M. Kazmierski, R. J. Knapp, Nature 1991, 354, 82–84.

[5] R. Frank, Tetrahedron 1992, 48, 9217–9232.

[6] A. Dikmans, U. Beutling, E. Schmeisser, S. Thiele, R. Frank, QSAR Comb. Sci. 2006, 25, 1069-1080.

[7] R. J. Lipshutz, S. P. Fodor, T. R Gingeras, D. J. Lockhart, Nat. Genet. 1999, 21, 20-24.

[8] a) J. P. Pellois, X. Zhou, O. Srivannavit, T. Zhou, E. Gulari, X. Gao, Nat. Biotechnol. 2002, 20, 922-926; b) S. P. Fodor, J. L. Read, M. C. Pirrung, L. Stryer, A. T. Lu, D. Solas, Science 1991, 251, 767-773.

[9] J. Jones in Oxford Chemistry Primers, (Ed: J. Jones), Oxford University Press, Oxford, 2002, pp. 1-92.

[10] P. M. Borsenberger, D. S. Weiss, in Handbook of Imaging Materials, second edition (Eds: A. S. Diamond, D. S. Weiss), Marcel Dekker, Inc., New York, 2002, pp. 369-423.

[11] M. Beyer, T. Felgenhauer, F. R. Bischoff, F. Breitling, V. Stadler, Biomaterials 2006, 27, 3505-3514.

[12] M. H. S. Cezari, L. Juliano, Peptide Res. 1996, 9, 88-91.

[13] a) K. Hilpert, G. Hansen, H. Wessner, G. Küttner, K. Welfle, M. Seifert, W. Höhne, Protein Eng. 2001, 14, 803-806; b) J. W. Slootstra, D. Kuperus, A. Plückthun, R. H. Meloen, Mol. Diversity 1997, 2, 156-164.

[14] M. Beyer, A. Nesterov, I. Block, K. König, T. Felgenhauer, S. Fernandez, K. Leibe, G. Torralba, M. Hausmann, U. Trunk, V. Lindenstruth, F. R. Bischoff, V. Stadler, F. Breitling, Science 2007, 318, 1888.

*Deutsches Krebsforschungszentrum, Arbeitsgruppe Chipbasierte Peptidbibliotheken, 69120 Heidelberg

**Fraunhofer-Institut für Produktionstechnik und Automatisierung IPA, 70569 Stuttgart

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