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Real-time-PCR

Real-Time-PCR – Im Echtzeitalter der Molekularbiologie

21.01.2008 | Autor / Redakteur: Olaf Spörkel* / Marc Platthaus

1 Haupteinsatzgebiet der Real-Time-PCR ist die Quantifizierung von Nukleinsäuren.
1 Haupteinsatzgebiet der Real-Time-PCR ist die Quantifizierung von Nukleinsäuren.

Die Real-Time-PCR ist eine etablierte Methode zur Nukleinsäurequantifizierung und Gensequenzanalyse mit einer großen Auswahl unterschiedlicher Gerätelösungen. Neben einer kleinen Standfläche fordern die Anwender heute Geräte, die für den Dauerbetrieb konzipiert sind. LaborPraxis hat sich bei den Herstellern umgesehen und präsentiert in einer Marktübersicht die neuesten Trends und Systeme.

Nach wie vor wird die Real-Time-PCR hauptsächlich zur absoluten und relativen Quantifizierung von Nukleinsäuren wie DNA, mRNA oder miRNA eingesetzt. Bis zu 80 Prozent der Applikationen erfolgen im Rahmen von Genexpressionsstudien. Darüber hinaus dient die Technik zur Genotypisierung, Genidentifikation oder zur Allelotypisierung. Ein stark wachsender Bereich ist z.B. die Validierung von RNAi-basierten Gene-Silencing-Experimenten. Auch beim Nachweis von Infektionskrankheiten wie HIV und HCV oder bei der Viruslast-Bestimmung in einer Blutprobe gehört die Technik zu den Routinemethoden in der klinischen Diagnostik.

Real-Time-PCR-Geräte im Vergleich

Das Prinzip der Real-Time-PCR hat sich seit den Anfängen zu Beginn der neunziger Jahre kaum verändert. Nach jedem PCR-Zyklus wird ein Fluoreszenzsignal gemessen und die zum gebildeten Amplifikat proportionale Fluoreszenzzunahme detektiert. Die Quantifizierung basiert auf Vergleichsmessungen mit definierten Standards. Hierfür werden in der Regel konstant exprimierte und nicht regulierte Referenzgene herangezogen. Die jeweilige Gerätesoftware nutzt unterschiedliche Rechenalgorithmen, um anhand der Signale die DNA-Mengen zu ermitteln.

Schnell und homogen

Mit den Geräteausmaßen fällt bereits auf den ersten Blick ein wichtiges Unterscheidungskriterium ins Auge. Da der Platz auf der Laborbench in der Regel knapp bemessen ist, sind kompakte und transportable Lösungen mit einer kleinen Standfläche begehrt. Die Funktionalitäten sind bei diesen Systemen jedoch häufig begrenzt.

Schnelle Heiz- und Kühlraten verkürzen die Analysenzeiten, können allerdings auch die homogene Verteilung und exakte Einhaltung der Temperatur erschweren. Um reproduzierbare Ergebnisse erzielen zu können, muss an jeder Position des Blocks zur gleichen Zeit die gleiche Temperatur herrschen. Während Anbieter wie Applera, Bio-Rad Laboratories oder Eppendorf hierfür Peltier-Elemente einsetzen, arbeiten der Smartcycler und das Genexpert-System von Genzyme Virotech mit einer Kombination aus keramischer Heizplatte und Lüfter. Die Rotor-Gene (Corbett/Ltf-Labortechnik) und Lightcycler-Systeme (Roche) verwenden dagegen Luft als Heiz- und Kühlmedium und erzielen Temperatursprünge von 15 bzw. 20 °C pro Sekunde. „Die Temperierung ermöglicht eine hohe Temperaturuniformität“, erklärt Dr. Rudolf Walser, Support bei Ltf Labortechnik. So ließen sich im Rahmen der hochauflösenden Schmelzkurvenanalyse auch noch solche SNPs (single-nucleotide-polymorphisms) nachweisen, die aufgrund des geringen Temperaturunterschieds zum Wildtyp (0,2 °C) mit anderen Systemen kaum detektierbar seien, ergänzt Walser. In den Corbett-Systemen befinden sich die Proben während der PCR-Reaktion in einem rotierenden Karussell. Zwischen den Reaktionsgefäßen sollen dadurch Temperaturunterschiede von maximal 0,01 °C auftreten. Die resultierende Zentrifugalkraft verhindert zudem Kondensatbildung oder Randeffekte.

Einige Real-Time-PCR-Systeme verfügen über einen frei programmierbaren Temperaturgradientenmodus. Diese Funktion bietet die Möglichkeit, mehrere Parameter einer Reaktion zeitgleich anzupassen und zu überprüfen. Reaktionsbedingungen wie die Zusammensetzung des Mastermixes oder die Annealingtemperatur der Primer lassen sich mithilfe des Gradienten schnell und ohne viel Aufwand in einem PCR-Lauf validieren.

Licht und Farbe

Die Anregung der Fluorophore kann mit Halogen-, Laser oder LED-Lichtquellen erfolgen. LEDs haben den Vorteil, dass sie robust sind, eine extrem lange Lebensdauer aufweisen und nach einer initialen Kalibrierung praktisch wartungsfrei sind. Die von Genzyme Virotech vertriebenen Geräte sind mit jeweils vier LEDs ausgestattet, das neue CFX96-System von Bio-Rad Laboratories verfügt über sechs farbige LEDs. Die Mastercycler von Eppendorf wiederum können mit 96 LEDs bis zu 96 Proben parallel anregen. Unterschiede in der Anregungsintensität, die durch bewegliche Lichtquellen entstehen können, sollen dadurch vermieden werden.

Zur Markierung der Gentargets kann der Anwender zwischen unspezifischen und spezifischen Sonden wählen. Sequenzunspezifische Farbstoffe wie Sybr-Green sind kostengünstig und hoch empfindlich. Allerdings lagert sich der Farbstoff in jeden Doppelstrang ein, sodass auch unerwünschte Produkte wie Primerdimere detektiert werden. Taqman-, Scorpion-, Fret- und Molecular-Beacon-Sonden sind dagegen sequenzspezifisch und binden nur an komplementäre Basenabfolgen.

In Abhängigkeit der Extinktions- und Emissionseigenschaften der eingesetzten Sonden und der zur Verfügung stehenden Fluoreszenzkanäle erlauben die PCR-Geräte Multiplex-Analysen – den Nachweis mehrerer Zielsequenzen in einer einzelnen PCR-Reaktion. Das Lightcycler-480-Gerät bietet z.B. fünf Anregungsfilter und sechs Filter für die Detektion, die sich untereinander flexibel kombinieren lassen.

Die Anzahl der messbaren Fluorophore ist jedoch nicht zwingend identisch mit der Anzahl nachweisbarer Zielsequenzen. Einige Systeme verwenden optional Referenzfarbstoffe, sodass ein Fluoreszenzkanal keine Zielsequenzen misst. Das iQ5- und CFX96-System dagegen ermöglichen der Anzahl ihrer Kanäle entsprechend eine Multiplexdetektion von bis zu fünf Zielgenen in jedem Well.

Analyse und Darstellung

Zur Bearbeitung der Rohdaten bieten die Hersteller umfangreiche Softwarelösungen an, die das komplexe Datenmaterial aus dem Experiment auswerten, interpretieren und grafisch darstellen sollen. In Abhängigkeit der Fragestellung stehen interaktive und statistische Analysewerkzeuge zur Verfügung, die laut Hersteller alle intuitiv und einfach zu bedienen sind. Sie führen den Anwender durch den kompletten Analyseprozess und unterstützen verschiedene Verfahren zur Auswertung des Experiments. In diesem Punkt unterscheiden sich die einzelnen Softwarelösungen deutlich. Die „all candidates“-Funktion dient z.B. der PCR-Validierung und Optimierung. Während der Zeitintervalle für Denaturierung, Annealing und Elongation wird in jedem PCR-Zyklus die Produktzunahme über eine Sybr-Green-Fluoreszenzzunahme angezeigt. „Basierend auf diesen Informationen kann der Anwender alle Zeitintervalle soweit verkürzen, dass die PCR-Reaktion bei gleichbleibender Effizienz schneller beendet ist“, erklärt Dr. Marcus Neusser, Produktmanager Europa, für den Bereich Genexpression, Bio-Rad Laboratories. Diese Optimierung spare bei Systemen mit Thermoblock mehr Zeit ein, als durch ein schnelles „Ramping“ (Heizen/Kühlen der PCR) gespart werden könne. In der Regel betrage die Dauer der Denaturierung-, Annealing- und Elongationsphase ein Mehrfaches der Aufheiz- und Abkühlphasen.

Applera Deutschland führt derzeit einen Relaunch der 7500er-Systemfamilie mit neuer Software durch. Diese beinhaltet z.B. einen Reaktionsmixkalkulator, der die Mengen jeder benötigten Reaktionskomponente berechnet. Zudem ist ein Analysepaket für Genexpressionsstudien mit einer unbegrenzten Plattenanzahl und mehreren endogenen Kontrollen enthalten. Für das 7500-Fast-Gerät wurden hochauflösende Schmelzkurvenanalysen (HRM) in den Applikationsumfang aufgenommen.

Das Lightcycler-480-System ist mit einer Software ausgestattet, die im Rahmen einer Mikrotiterplatten-basierten Real-Time-PCR eine hochauflösende Schmelzkurvenanalyse ermöglicht. Der Rotor-Gene 6000 HRM setzt hierfür auf ein Rotorensystem mit bis zu 100 Proben.

Die HRM ist eine neue post-PCR-Methode, die auf der Suche nach unbekannten Genvarianten innerhalb eines Pools von PCR-Produkten als Ergänzung oder Alternative zur DNA-Sequenzierung eingesetzt werden kann. Bei der HRM wird im Anschluss an eine PCR-Reaktion die Temperatur sukzessiv erhöht, sodass sich in Abhängigkeit der jeweiligen Schmelzpunkte die amplifizierten DNA-Doppelstränge nach-einander in ihre Einzelstränge auftrennen. Die resultierende Abnahme der Fluoreszenz wird gemessen und in Form einer DNA-Schmelzkurve dargestellt. Da Mutationen die Form der Kurve beeinflussen, erlaubt die HRM genetische Variationen wie SNPs oder Deletionen in einem PCR-Produkt zu analysieren. Zudem lassen sich aufgrund der geringeren Schmelztemperatur unspezifische Produkte wie Primerdimere nachweisen. Zu den wichtigsten Anwendungen dieser Methode gehört jedoch die Gen-identifikation.

Reproduzierbarkeit

Da die Real-Time-PCR-Geräte alle technisch ausgereift sind, ist die Reproduzierbarkeit eines Experiments in erster Linie von der konzeptionellen Ausarbeitung und Strategie abhängig. „Jeder Pipettierfehler wird exponentiell bestraft. Eine wichtige Voraussetzung für die Reproduzierbarkeit eines Versuchs sind Probenvorbereitung und Pipettierung der Gentargets und des Reagenzienmixes“, erläutert Dr. Thomas Schild, europäischer Marketingmanager Real-Time-PCR von Applied Biosystems. Pipettierroboter und automatisierte Systeme zur Probenextraktion sorgen für eine vergleichbare Qualität des Ausgangsmaterials und empfehlen sich für Routineapplikationen.

Die Marktübersicht ist in Kürze online verfügbar. Bezüglich der Anbieter erhebt der tabellarische Vergleich keinen Anspruch auf Vollständigkeit. Die veröffentlichten Daten und Aussagen basieren auf Angaben der jeweiligen Anbieter.

Dr. O. Spörkel, Labscience Communications, 85567 Grafing

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