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SPECIAL DETEKTION

TIRF-Immunoassay mit Fluoreszenzdetektion

| Autor/ Redakteur: Dipl.-Chem. Jens Tschmelak*, Dipl.-Biol. t.o. Günther Proll*, Prof. Dr. Rer. Nat. Günter Gauglitz* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Dieser Beitrag beschreibt die Entwicklungen im Bereich der TIRF-basierten Biosensoren bis zum vollautomatisierten Immunoassay RIANA (River Analyser) für die Gewässeranalytik.

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( Archiv: Vogel Business Media )

Dieser Beitrag beschreibt die Entwicklungen im Bereich der TIRF-basierten Biosensoren bis zum vollautomatisierten Immunoassay RIANA (River Analyser) für die Gewässeranalytik. Neben den jüngsten Erfolgen, welche das Leistungsvermögen dieses Systems belegen, wird auch ein Ausblick in die kommenden Jahre gemacht.

Verschiedene Aufbauten von TIRF-Geräten für biologische Anwendungen sind bereits publiziert worden.Unterschiede liegen hierbei in der mono-analytischen bzw. multi-analytischen Verwendung.

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Einzelanalyt-MethodenDer Biosensor von Abel et al. (1996) zählt zu den Einzelanalyt-Methoden, beruht auf der Anregung über eine optische Faser und wurde für den Nachweis von fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden verwendet. Der Biosensor besteht aus einer Quarzfaser mit einem Durchmesser von 1 mm und einer Länge von 65 mm, die in eine Durchflusszelle mit 75 µL Volumen hineinragt. Mit einem Argonionenlaser wird der Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein angeregt und die Fluoreszenz mit einem Fotomultiplier detektiert. Mitdiesem Aufbau war es möglich, 1.3 pg mL-1 16-mer DNA nachzuweisen.

Eine weitere Einzelanalyt-Methode haben Schult et al. (1999) vorgestellt. Sie haben einen TIRF-Sensor aufgebaut, der einen Einweg-Chip aus PMMA trägt. Dieser Chip ist auf einem Prisma fixiert, in das Laserlicht mit einer Wellenlänge von 638 nm eingekoppelt wird. Die Leistung des Lasers wird auf 0.06 W mm-2 beschränkt, damit zeitauflösende Messungen ohne Fotobleaching-Effekt durchführbar sind. Das Fluoreszenzlicht, das durch Anregung auf dem Sensorchip erhalten wird, wird durch das Prisma hindurch über ein Linsen- und Filtersystem auf einen Fotomultiplier fokussiert. Mit einer automatisierten Fluidik wurde das System des Schwangerschaftshormons Chorionic Gonadotropin (hCG) in Blutserum untersucht und eine Nachweisgrenze von 1 ng mL-1 hCG erreicht.

Eine Weiterentwicklung dieses Sensorsystems wird in Peter et al. (2001) beschrieben. Zwischen dem Linsensystem und dem Fotomultiplier wurde ein beweglicher Shutter eingebaut, der es erlaubt, an zwei Spots zu messen. Damit wurde eine Nachweisgrenze für Cy5-markierte 56mer-DNA von 0.21 nmol L-1 erreicht.

Multianalyt-MethodenNeben diesen Einzelanalyt-Sensoren wurden auch verschiedene TIRF-Sensoren für die Multi-Analyt-Detektion entwickelt. So zum Beispiel berichten Plowman et al. (1999) von einem integriert optischen Wellenleiter, bei dem das Laserlicht einer Laserdiode mit einer Wellenlänge von 635 nm über ein Gitter in einen monomodigen Wellenleiter mit drei optischen Kanälen eingekoppelt wird. Mit einer CCD-Kamera wird das Fluoreszenzlicht nach vorherigem Filtern durch einen Bandpassfilter detektiert.

Ein bulkoptischer TIRF-Sensor für Multi-Analyt-Messungen wird von Schuderer et al. (2000) präsentiert. Bei diesem Sensor wird eine Laserdiode mit 635 nm direkt oder ein Laser mit einer Wellenlänge von 488 nm über eine Faser eingekoppelt. Mit einem Linsensystem und Interferenzfiltern wird das Fluoreszenzlicht auf einen Fotomultiplier fokussiert. Der Laser wird moduliert und das Fluoreszenzlicht mit Lock-In-Technik ausgelesen. Auf dem Transducer wird eine Flusszelle mit vier Kanälen über O-Ringe angepresst. Um alle Kanäle auszulesen, wird der Transducer samt Fluidik über einen Schrittmotor verschoben, wobei die Anordnung von Laser und Fotomultiplier fixiert bleibt. Der Sensor wird mit Oligonukleotiden beschichtet, und fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide können in Konzentrationen von 1 nM detektiert werden.

Zuletzt soll noch ein in Rowe et al. (1999) und Rowe-Taitt et al. (2000) beschriebener Multi-Analyt-TIRF-Sensor vorgestellt werden. Dieser besteht aus einem mit Silber überzogenen Transducer, in den ein aufgeweiteter Laserstrahl mit einer Wellenlänge von 635 nm eingekoppelt wird. Die Beschichtung verringert die Intensitätsverluste durch Transmission von Laserlicht an den Epoxyklebestellen der 6-Kanal-Flusszelle und dem Transducer. Über ein Linsenarray für 30 Spots wird das Licht auf eine CCD-Kamera fokussiert. Dieser Aufbau wird für die Bestimmung von Bakterien, Viren und Toxinen verwendet. Bacillus globigii kann mit 105 „colony forming units“ pro Milliliter, MS2 Bakteriophagen mit 107 „plaque forming units“ pro Milliliter und das Staphylococcen-Toxin Enterotoxin B mit 10 ng mL-1 nachgewiesen werden.

RIANA - River AnalyserIn der vorliegenden Arbeit wurde ein Gerät verwendet, das innerhalb des von der EU geförderten Projekts RIANA (River Analyser Projekts, Förderkennzeichen: ENV4-CT95-0066) gebaut und speziell für die Wasseranalytik konzipiert wurde. Mit diesem Gerät lassen sich sechs Analyte in einer Wasserprobe gleichzeitig innerhalb von 12 Minuten mit einer automatisierten Fluidik bestimmen (Klotz et al. 1998). Der Detektionsaufbau ist extrem kostengünstig, da das Gerät mit Fotodioden ohne fokussierende Optik ausgestattet ist. Insgesamt ist der Sensor sehr robust, so dass er auch im Rahmen von Feldeinsätzen Verwendung finden kann.

Der optische Aufbau des RIANA-Gerätes (Abb. 1) besteht aus einer Laserdiode, die einen Abstand von 2 bis 5 cm vom Transducer hat. Über die angeschrägte Kante des Glastransducers wird das Laserlicht in diesen eingekoppelt (Klotz et al. 1998; Brecht et al. 1998). Durch Totalreflexion wird der Strahl innerhalb des Transducers weitergeleitet, wobei sich die Reflexionspunkte in einem Abstand von ungefähr 6.5 mm befinden. An diesen Stellen entsteht oberflächennah in der Flusszelle ein evaneszentes Feld, in dem Fluoreszenzfarbstoffe angeregt werden können. Auf der Rückseite des Transducers leiten Polymerfasern die Fluoreszenz über Kantenfilter zu den Fotodioden (Abb. 1).

Durch die eingesetzte Lock-In-Technik wird das Laserlicht moduliert, und nur die ankommende, entsprechend modulierte Strahlung wird detektiert. Dadurch wird das Rauschen, welches zum Beispiel durch Umgebungslicht oder elektromagnetische Störstrahlung verursacht wird, verringert. Die Signale werden online mit dem PC aufgezeichnet. Da die Einsammeleffizienz des Polymerleiters ohne Sammeloptik sehr gering ist, muss die Intensität des anregenden Lichts hoch sein, damit ein genügend starkes Signal detektiert werden kann. Als Folge wird der Farbstoff extrem schnell gebleicht. Deshalb kann die Bindung des Antikörpers an die Oberfläche nicht zeitaufgelöst gemessen werden. Stattdessen wird die Laserdiode während des Injizierens ausgeschaltet und erst wieder angeschaltet, wenn die Probe vollständig über den Transducer geflossen ist und die Flusszelle gewaschen wurde. Das höchste Signal ergibt nach Abzug der Basislinie (vor dem Injizieren) das eigentliche Signal (Abb. 2).

Die Fluidik des RIANA-Systems wurde im Vergleich zu dem ursprünglich im EU-Projekt verwendeten Autosampler AS91 verändert. Auf die Messungen hat dies nur insofern Auswirkungen, dass die Genauigkeit der Fluidik mit dem HTC-PAL Autosampler von der CTC Analytics AG (Schweiz) deutlich größer ist als zuvor. Beim HTC-PAL wird die Probe vom Autosampler selbst gemischt und in die Probenschleife des 6-Wege-Valcoventils injiziert. Danach pumpt die RIANA-Spritzenpumpe die Probe langsam durch die Flusszelle über die Sensoroberfläche. Dadurch kann zum einen ein maximales Probenvolumen verwendet werden, da es kaum zu Verlusten durch Totvolumina kommt. Zum anderen wird die Probe im RIANA nur einmal gepumpt, aber nicht durch Aufsaugen dekomprimiert, wodurch eine geringere Dispersion erreicht wird und insgesamt eine deutliche Zeitersparnis zu verzeichnen ist. Zusätzlich kann der Antikörper direkt vor der Messung zur Probe gegeben werden.

Dies hat mehrere Vorteile: Erstens ist das Zeitintervall zwischen Mischen und Messung immer gleich, zweitens wird der Antikörper geschont, da er sich nur relativ kurze Zeit in eventuell aggressiven Matrizes befindet, und drittens kann der Antikörper im Vorratsgefäß gekühlt gelagert werden, ohne dass der komplette Probenteller gekühlt werden muss. Durch Verwendung dieses Autosamplers ergeben sich also immense Vorteile für die Messung, was sich anhand geringerer Standardabweichung bei Mehrfach-Messungen belegen lässt.

DatenauswertungFür die Berechnung von analytischen Qualitätsmerkmalen bei Einzelanalyt-Kalibrierungen werden sämtliche Analytkonzentrationen mindestens dreifach gemessen und damit die Kalibrierung robuster dargestellt. Der Blindwert wird mindestens neunmal bestimmt. Aus den erhaltenen Daten der Replika werden der Mittelwert -y-, die Standardabweichung sdy und aus denen der Blindwert-Messungen y0 die Erkennungsgrenze ydec bestimmt. Diese stellt den y-Wert der Nachweisgrenze dar. Hier wird die allgemein übliche Definition benutzt, bei der der Studentfaktor gleich 1.5 gesetzt wird und für homoskedatische Standardabweichungen gilt (Miller et al. 1988). Die Bestimmungsgrenze ydet errechnet sich aus der zehnfachen Blindwertstandardabweichung. Die Standardabweichung der Umkehrfunktion sdx berechnet sich aus sdy und der Steigung y' der Kurve in dem Punkt, wenn als Näherung ein linearer Zusammenhang gewählt wird (Dudley et al. 1985). Mit sdx lässt sich der Variationskoeffizient xcv,i eines Wertes bestimmen, aus dem ein Präzisionsprofil resultiert, welches die Präzision einer Kalibrierung angibt. Die Präzision entspricht dem höchsten Variationskoeffizienten innerhalb des Arbeitsbereichs.

Die Kurvenanpassung einer Kalibrierkurve erfolgt mit der Logistik-Funktion (Dudley et al. 1985):

Hier ist A1 der höchste y-Wert, A2 der kleinste y-Wert und x0 ist der Testmittelpunkt (auch als IC50 zu interpretieren). Die Steigung der Logistikfunktion beziehungsweise der so genannte „Steigungsfaktor“ ist durch den Parameter p bestimmt. Um die Richtigkeit einer Kalibrierung festzustellen, lässt sich die Wiederfindungsrate ermitteln. Dazu werden Realproben, deren Analytkonzentrationen mit klassischen analytischen Methoden (beispielsweise GC-MS oder HPLC-DAD) bestimmt wurden, mit dem Sensor gemessen und die Daten verglichen, oder es werden Matrizes verwendet, die den entsprechenden Analyten in nicht nachweisbaren Konzentrationen enthalten und mit diesem Analyten dotiert werden. Die Wiederfindungsrate WFR für Testproben ergibt sich aus dem Mittelwert der Replika-Messungen -x- und dem wahren Wert xw:

AnwendungenDas RIANA-System hat sich bei der Detektion verschiedenster kleiner organischer Moleküle in wässrigen Proben bewährt. Der Fokus lag lange Zeit im Bereich der Pestizide (z.B. Atrazin, Simazin, 2,4- D, Isoproturon, Alachlor, PCP und Acetochlor), die schon seit längerem für ihr ökotoxikologisches Potenzial bekannt sind. Für diese Substanzen bestehen seit einiger Zeit Richtlinien der Europäischen Union für die maximale Konzentration im Trinkwasser (0.1 µg L-1 für Einzelsubstanzen und 0.5 µg L-1 in der Summe). In der jüngsten Zeit wurde die Palette der detektierbaren Analyte stark erweitert. So sind mittlerweile viele estrogene Substanzen, Industriechemikalien, Hormone, Antibiotika und weitere Pharmaka im unteren Nanogramm-pro-Liter-Bereich mit dem RIANA-System detektier- und quantifizierbar geworden. Bei Messungen mit Gewässerproben (Trink-, Grund- und Oberflächenwasser) und synthetischem Abwasser konnten Wiederfindungsraten zwischen 70 und 120% erreicht werden, wie dies von der AOAC (Association of Analytical Communities) international gefordert wird.

Unter anderem wurde ein Assay für die Detektion von sieben verschiedenen Sulphonamiden (Sulphadimidin, Sulphamethizol, Sulphadiazin, Sulphamethoxypyridazin, Sulphamethoxazol, Sulphadimethoxin und Sulphathiazol) entwickelt, wobei Nachweisgrenzen zwischen 2.7 und 6.6 ng L-1 erzielt wurden (Tschmelak et al. 2004). Auch für die Detektion von endokrin wirksamen Substanzen wurde am Beispiel von Estron ein Assay entwickelt und bis an die bisherigen gerätetechnisch bedingten Grenzen optimiert. Dabei konnte das natürliche Hormon Estron mit einer Nachweisgrenze von 0.19 ng L-1 ohne Probenanreicherung und weitere Probenvorbereitung direkt detektiert werden (Tschmelak et al. 2004). Im Vergleich zu klassischen analytischen Methoden wie GC- oder HPLC-MS liegt der klare Vorteil in der schnelleren und kostengünstigeren Analyse. Das letzte Beispiel für Estron belegt das hervorragende Potenzial der Fluoreszenzdetektion bei TIRF-basierten Biosensoren.

Ausblick

Im Projekt AWACSS (Automated Water Analyser Computer Supported System) der Europäischen Union (Förderkennzeichen: EVK1-CT-2000-00045) wird ein TIRF-Biosensor entwickelt, mit dem die parallele Detektion an bis zu 32 Spots unter Einsatz eines integriert optischen Transducers mit einem neuen Mikrofluidiksystem ermöglicht werden soll. Dieses vollautomatisierte System soll als Funktionsmuster dienen, um damit ein neues Anwendungsfeld in der kontinuierlichen und flächendeckenden Gewässerüberwachung zu erschließen. Es soll in der Lage sein, als Überwachungs- und Frühwarnsystem über einen längeren Zeitraum von mehreren Wochen selbstständig zu arbeiten.

Auch die Weiterentwicklung des bereits etablierten RIANA-Systems soll vorangetrieben werden. Das Gerät soll durch sukzessiven Austausch einzelner Komponenten weiter verbessert und dadurch für die Erreichung noch niedrigerer Nachweisgrenzen optimiert werden. Zudem soll, in Ergänzung zu den bereits erreichten Nachweisgrenzen im Pikogramm-pro-Liter- Bereich für das natürliche Hormon Estron, ein hoch sensitiver EDC-Assay für alle vier Klassen von endokrin wirksamen Substanzen, d.h. natürliche Estrogene (z.B. Estron, Estradiol, Estriol), synthetische Estrogene (z.B. Ethinylestradiol, Tamoxifen), Phytoestrogene (z.B. Genistein, Coumestrol) und Xenoestrogene (z.B. Bisphenol A, Nonylphenol, DDT) entwickelt werden.

*Eberhard-Karls-Universität Tübingen Institut für Physikalische und Theoretische Chemie (IPTC), Auf der Morgenstelle 8, 72076 Tübingen, jens.tschmelak@ipc.uni-tuebingen.de

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