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HPLC

Vergleich und Auswahl moderner Reversed-Phase-Säulen

| Autor/ Redakteur: Antoni Kromidas*, Hans-Joachim Kuss** und Stavros Kromidas*** / Marc Platthaus

Die große Auswahl an Reversed-Phase-Materialien macht es dem Anwender zunehmend schwerer, die für ihn richtige Säule zu finden. Erschwerend kommt hinzu, dass Bezeichnungen sich häufig ähneln oder Kunstnamen verwendet werden. Mit systematischen Messungen wurden mehrere neue Säulen getestet und miteinander verglichen. Nachfolgend sind die Ergebnisse zusammengefasst.

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Abb. 1: Einteilung kommerziell erhältlicher Säulen nach Hydrophobizität und Polarität (Gruppe A: eher hydrophob, Gruppe B: eher polar bis mittelpolar, Gruppe C: ausgeprägt polar).
Abb. 1: Einteilung kommerziell erhältlicher Säulen nach Hydrophobizität und Polarität (Gruppe A: eher hydrophob, Gruppe B: eher polar bis mittelpolar, Gruppe C: ausgeprägt polar).
( Archiv: Vogel Business Media )

In jüngster Zeit haben die Säulenhersteller eine Vielzahl neuer Reversed-Phase-Materialien (RP) eingeführt. Um dem Anwender eine Hilfestellung bei der Auswahl zu bieten, wurden mehrere Säulen im Rahmen einer umfangreichen Untersuchung mithilfe von zwei aussagekräftigen Visualisierungstools verglichen [1, 2]. Als Kriterium für die Ähnlichkeit der RP-Säulen diente ausschließlich die Selektivität (Trennfaktor a) bei der Trennung unterschiedlicher Analyte. Weitere Kriterien wie der Retentionsfaktor k oder die Bodenzahl N wurden nicht berücksichtigt. Der k-Wert besitzt aus Anwendersicht keine hohe Priorität, während die Bodenzahl von vielen Faktoren abhängt. Nur eine aufwändige und nicht unumstrittene Normierung erlaubt, Aussagen bezüglich vergleichbarer Bodenzahlen zu gewinnen.

Andere chromatographische Bedingungen und Substanzklassen können selbstverständlich abweichende Ähnlichkeiten ergeben. Die Verwendung unterschiedlicher Analyttypen bei mehreren Säule-Eluent-Kombinationen sollte dennoch zu einer allgemeingültigen Aussage geführt haben. Zur visuellen Darstellung der Ähnlichkeiten dienten die Selektivitätskarten und Selektivitätshexagone.

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Selektivitätskarten

In Abbildung 1 sind 23 kommerzielle Säulen in Gruppen mit ähnlichem Charakter zusammengefasst. Säulen der Gruppe A weisen einen eher hydrophoben, Säulen der Gruppe B einen eher polaren bis mittelpolaren und Säulen der Gruppe C einen ausgeprägt polaren Charakter auf.

Die Selektivitätskarte ist vielseitig einsetzbar und eignet sich beispielsweise, um eine effektivere Säule bei Optimierungsversuchen zu finden. Hat man im Zuge einer Methodenentwicklung z.B. Pursuit C18 (Gruppe A) mit mäßigem Erfolg getestet, ist es unwahrscheinlich, dass eine Säule mit ähnlichen Eigenschaften wie Discovery C18 oder Sunfire eine bessere Trennung ermöglicht. Materialien aus der Gruppe B, z.B. Synergi Fusion-RP, oder Gruppe C, z.B. XBridge Shield, wären aufgrund der unterschiedlichen Selektivität dagegen Erfolg versprechender.

Ist eine Säule wie Polaris C18-A nicht liefer- oder in der gewünschten Säulendimension nicht verfügbar, lässt sich mithilfe der Selektivitätskarte schnell eine alternative Säule, in diesem Fall z.B. Atlantis dC18, finden, die eine ähnliche Selektivität aufweist.

Darüber hinaus eignen sich die Karten, um bei einer Methodenentwicklung die in Frage kommenden Säulen einzugrenzen. Muss eine neue Trennmethode für eine unbekannte Probe entwickelt werden, können z.B. jeweils zwei Säulen aus den drei unterschiedlichen Bereichen (hydrophob, mittelpolar, stark polar) kombiniert über ein Säulenschaltventil parallel getestet werden. Mit großer Wahrscheinlichkeit resultiert aus einer der sechs Säulentrennungen ein Chromatogramm, das als Basis für die weitere Feinoptimierung genutzt werden kann. Schließlich lässt sich mit der Selektivitätskarte auch eine geeignete Säule für orthogonale Tests finden. Die Tests (gleiche Säule und anderer Eluent oder gleicher Eluent und andere Säule) stellen ein hervorragendes Werkzeug dar, um die Peakhomogenität zu überprüfen. Je weiter eine Säule in der Selektivitätskarte von der aktuell verwendeten entfernt liegt, desto geeigneter wäre sie für ein Experiment dieser Art. Bei der Trennung von trizyklischen Antidepressiva eluiert eine polare Verunreinigung an allen klassischen, hydrophoben Säulen der Gruppe A wie Sunfire inert. Erst die Verwendung von Primesep C 100, einer C18-Säule mit einem zusätzlich eingebauten komplexfähigen Liganden, ermöglicht das Retardieren und die Quantifizierung der polaren Verunreinigung (s. Abb. 2).

Selektivitätshexagone

Bei den Selektivitätshexagonen entsprechen die sechs Ecken normierten Trennfaktoren (a-Werte), die bei der Trennung von Analytpaaren an einer Säule gemessen werden. Abbildung 3 zeigt eine Auswahl an Selektivitätshexagonen, die das Selektivitätsverhalten neuerer Säulen und im Vergleich dazu das eines älteren Materials (Spherisorb ODS 2) für unterschiedliche aromatische Verbindungen wiedergeben. Säulen, die Perylen und Chrysen (a-Per/Chr) effektiv trennen, weisen eine hohe aromatische Selektivität auf und eignen sich zur Analyse unsubstituierter, hydrophober Aromaten. Die Trennung von Triphenylen und o-Terphenyl (a-Triph/o-Ter) basiert auf sterischer Selektivität. Säulen mit dieser Eigenschaft können am ehesten planare von nicht planaren Molekülen und sterisch anspruchsvolle Moleküle wie Stellungsisomere, Steroide oder verdrillte Strukturen trennen. Beim Ethylbenzol-Fluorenon-Paar (a-EB/Fl) hängt die Selektivität vom hydrophoben Charakter ab. Säulen mit hohen a-Normetanephrin/Epinephrin-Werten können Amine über ihren hydrophoben Charakter selektiv trennen. Das Terephthal-/Phthalsäure-Paar (a-Terepht./Phtal) ist ausgelegt, um Säulenmaterialien zu identifizieren, die starke aromatische Säuren trennen können. Das Analytpaar a-Nicotinsäure und Ascorbinsäure liefert Werte für die Selektivität bei eher schwachen aromatischen Säuren.

Abbildung 3 zeigt, dass die Hexagone einen direkten Vergleich der Säulenmaterialien ermöglichen. So sind Ascentis RP-Amide und Discovery Amide C16 polarer als Acclaim PA C16. Die beiden C16-Phasen verfügen über polare Gruppen, die ionische Wechselwirkungen mit starken Säuren eingehen können und eine hohe Selektivität ermöglichen. Acclaim PA C16 zeigt dagegen eine bessere sterische Selektivität.

Synergi Fusion-RP ist wiederum geringfügig polarer als Sunfire. Die Selektivität für das Terephthal-/Phthalsäure-Paar ist höher, die für Nicotinsäure und Ascorbinsäure sowie Ethylbenzol und Fluorenon etwas niedriger als bei Sunfire. Synergi Hydro RP ist hydrophober und polarer. Hydrophobe und polare Analyten werden an Synergi Hydro RP selektiver getrennt.

Die zu den C18-Resten zusätzlich vorhandene kurze Alkylkette mit der Phenyl- Endgruppe bei Nucleodur Sphinx RP bewirkt keine erhöhte Selektivität zur Trennung von starken aromatischen Säuren, beschert dem Material jedoch eine bedeutende sterische Selektivität. Die kurze Alkylkette mit der Phenyl-Endgruppe verleiht der Phase zudem einen bifunktionellen Charakter. Selektivitätshexagone können eingesetzt werden, um ähnliche Säulen für eine Substanzklasse zu finden. XBridge C18 und YMC Pro C18 RS stellen z.B. vergleichbare Phasen dar, wenn es um die Trennung von aromatischen Verbindungen geht.

Die Hexagone helfen auch bei der Suche nach einer geeigneten Säule für die Trennung einer konkreten Substanzklasse. Starke, aromatische Säuren lassen sich z.B. an Primesep C 100 trennen. Das Säulenmaterial weist einen großen Trennfaktor bei der Trennung der zwei starken Säuren Terephthal- und Phthalsäure auf. Schwach aromatische Säuren dagegen wie Nicotinsäure und Ascorbinsäure werden an den hydrophoben RP-Phasen XBridge C18, Nucleodur C18 Gravity, YMC Pro C18 RS oder Synergi Hydro-RP gut getrennt.

Die Analyse von Proben mit verschiedenen aromatischen Komponenten erfordert eine Säule, die möglichst unterschiedliche aromatische Verbindungen selektiv trennen kann. Je symmetrischer das Hexagon ist, desto universell einsetzbarer ist die entsprechende Säule für diese Fragestellung (z.B. Uptisphere UP5MM1). Spielt die sterische Selektivität keine Rolle, wäre Nucleodur Sphinx RP eine einsetzbare Säule. Ist zudem eine gute Selektivität für stark aromatische Säuren unwichtig, kämen alle hydrophoben Phasen in Frage. Der Vergleich der Hexagone ermöglicht eine schnelle und gezielte Auswahl geeigneter Säulen für orthogonale Tests.

Literatur

[1] S. Kromidas (Hrsg) „HPLC richtig optimiert“, 2007, Wiley-VCH

[2] Software „RP-Explorer 2007“, www.rp-explorer.de

*A. Kromidas, z.Zt. Waters Chromatography, Milford, USA, **Dr. H.-J. Kuss, Psychiatrische Klinik LMU München, 80336 München, ***Dr. S. Kromidas, 66125 Saarbrücken

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