Echtzeit-Testsystem Zellbasiertes toxikologisches Echtzeit-Testsystem zur Verringerung von Tierversuchen

Derzeit werden Versuchstiere in großer Zahl eingesetzt, um für pharmazeutische Produkte wie Botox die Freigabe zu erhalten und um die Kardiotoxizität neuer Arzneimittel vorherzusagen. Das xCELLigence System könnte die Tierversuche bei dieser Art von Tests ersetzen.

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Mit dem xCELLigence System wurden in-vitro-Tests von ausgewählten mikrobiellen Toxinen wie Botox aus Clostridium botulinum und dem nahe verwandten Toxin von C. difficile sowie in-vitro-Kardiotoxizitätstests von Arzneimittelkandidaten durchgeführt.

Assays für mikrobielle Toxine

Der zellbasierte Assay auf dem xCELLigence System liefert kinetische Informationen, die mit anderen Technologien nicht verfügbar sind. Das System wurde zum direkten Nachweis der Toxine A und B von Clostidrium difficile aus Stuhlproben eingesetzt. Dies erfolgte mittels Zellkulturen und spezifischer Toxin-Neutralisierung mit hochspezifischen Antikörpern gegen Toxin A und B. Der Test, wie er mit dem xCELLigence System durchgeführt wurde, ist extrem sensitiv (im pg/ml-Bereich) und hochspezifisch (siehe Abbildung 1).

Das System wurde auch erfolgreich zum Nachweis der Zytotoxizität von Botulinumtoxin eingesetzt. Für die Freigabe von Botulinumtoxin Typ A gibt es bisher kein in-vitro-Testsystem, das von der amerikanischen Zulassungsbehörde FDA oder anderen internationalen Regulierungsbehörden zugelassen ist. Mit dem xCELLigence System ist es gelungen, die Toxin-spezifische Zytotoxizität in zwei Zelllinien des Zentralen Nervensystems festzustellen. Es handelt sich um eine A172 Glioblastom-Zelllinie und eine SH-SY5Y Neuroblastom-Zelllinie (siehe Abbildung 2). Die vorläufigen Ergebnisse aus einem zellbasierten in-vitro-Test für Botulinumtoxin mit dem xCELLigence System deuten darauf hin, dass es möglich ist, den erforderlichen Tierversuch durch ein markierungsfreies, zellbasiertes Echtzeit-Testsystem auf xCELLigence zu ersetzen. Derzeit wird systematisch geprüft, welche anderen Zelllinien für diesen Assay verwendet werden können.

Assays zur Bestimmung der Kardiotoxizität

Ein anderer wichtiger Bereich, der durch das xCELLigence System erheblich beeinflusst werden könnte, ist die Einschätzung der Kardiotoxizität von Arzneimittelkandidaten. Auch hier werden gegenwärtig Tierversuche in großem Umfang durchgeführt. Es werden mittlerweile starke Anstrengungen unternommen, diese Tests durch in-vitro-Tests zu ersetzen. Ein gravierender Nachteil der gegenwärtigen in-vitro-Methoden zur Einschätzung der Kardiotoxizität ist jedoch ihre mangelnde Vorhersagbarkeit. Die Vorhersagbarkeit lässt sich erheblich verbessern, wenn ein markierungsfreier Echtzeit-Assay auf Basis von Kardiomyozyten auf dem xCELLigence System verwendet wird. Die vorläufige Untersuchung zeigt die Eignung des kontinuierlichen Echtzeit-Monitorings von Kardiomyozyten aus Mausstammzellen in Reaktion auf Testsubstanzen für den Nachweis früher, transienter Ionenkanal oder rezeptorvermittelter Effekte und der langfristigen Toxizität für Kardiomyozyten (siehe Abbildung 3) in derselben lebenden Zellpopulation. Dank der automatisierten Datenerfassung und des Hochdurchsatzformats des Assays lässt sich das xCELLigence System auch für das sekundäre Screening einsetzen und ermöglicht schon im frühen Stadium der Arzneimittelentdeckung die Vorhersage und Priorisierung der Kardiotoxizität.

xCELLigence System

Das xCELLigence System, entwickelt von ACEA Biosciences und von Roche und ACEA Biosciences gemeinsam weiterentwickelt, ermöglicht die markierungsfreie Analyse lebender Zellen. Das Herzstück des Systems ist ein integrierter mikroelektronischer Sensor, der sich in jeder der 96 Wells einer E-Plate befindet. Eine Zelle, die mit dem Sensor in Berührung kommt, verändert den elektrischen Widerstand zwischen den Mikroelektroden. Wird eine niedrige Wechselspannung (20 mV) angelegt, kann der Mikrosensor Veränderungen in der ionischen Umgebung der Vertiefung feststellen, die mit Veränderungen der Zahl der Zellen, der Zellmorphologie und der Stärke und Art der Zellanheftung am Boden des Mikrowells korrelieren. Die Zellen müssen nicht markiert werden und können über einen längeren Zeitraum unter nahezu physiologischen Bedingungen beobachtet werden. So können u.a. Messreihen aufgenommen und Wirkstoffkinetiken erstellt werden. Zudem lassen sich die Zellen mehrfach stimulieren, um beispielsweise Desensibilisierungseffekte oder das Ansprechen anderer Rezeptortypen zu untersuchen.

Das System ist geeignet für zellbasierte Untersuchungen wie

• Qualitätskontrolle von Zellen
• Proliferation von Zellen
• Zytotoxizität
• Adhäsion und Ausbreitung von Zellen
• Rezeptor-vermittelte Signalübertragung
• Barrierefunktion

Ausblick

Die Kombination des xCELLigence Systems mit anderen Systemen, die hohe Informationsdichten liefern, z.B. das 454 Genome Sequencer System und das Roche Nimblegen Array System, wird auf eine neue Ebene der Genauigkeit und Information von in-vitro-Tests führen. Dadurch wird sich die Zahl der erforderlichen Tierversuche in der Arzneimittelentwicklung erheblich reduzieren lassen.

* J. O’Connell, Y. Abassi, B. Xi, X. Wang und X. Xu, ACEA Biosciences, San Diego, Kalifornien, USA

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