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Dynamische Lichtstreuung

Der Weg zur perfekten Formulierung

| Autor / Redakteur: Dierk Roessner* und Roger Scherrers / Dr. Ilka Ottleben

(Bild: Wyatt)

Zu den kritischen Schritten beim Einsatz von Biopharmazeutika als therapeutische Produkte gehört auch die Entwicklung einer geeigneten Formulierung. Die Dynamische Lichtstreuung bietet eine schnelle Möglichkeit zur Protein-Charakterisierung und ist automatisierbar.

Der Marktanteil von biotechnologisch hergestellten Arzneimitteln betrug 2010 ca. 20% des Pharmamarktes in Deutschland, wobei monoklonale Antikörper den größten Anteil ausmachten [1]. Die Formulierungsentwicklung ist einer der kritischen Schritte beim Einsatz von Biopharmazeutika als therapeutische Produkte. Ziel der Formulierung ist die Stabilisierung der Proteine bzw. Protein-Komplexe und ihrer oft hochempfindlichen 3D-Struktur durch die Entwicklung eines geeigneten Formulierungspuffers.

Ergänzendes zum Thema
 
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Die Formulierung muss beständig gegenüber physikalischen und chemischen Einflüssen sein. Typische Probleme bei Proteinen in ihrer Darreichungsform sind kovalente und nicht-kovalente Aggregation, Desaminierung, Spaltung, Oxidation sowie Oberflächendenaturierung. Im Zuge der Entwicklung einer erfolgreichen Formulierung wird die Auswirkung verschiedener Hilfsstoffe wie Zucker, Salze, Antioxidationsmittel, Aminosäuren und Detergenzien auf die Stabilität des Produktes optimiert. Da die Kombinationen verschiedener Additive in unterschiedlichen Konzentrationen und Puffern mit verschiedenen pH-Werten untersucht werden, entstehen umfangreiche Testreihen.

Die Routinemethode für Charakterisierung und Quantifizierung von Proteinaggregaten im Rahmen von Formulierungsstudien ist die Größenausschlusschromatographie (SEC/GPC). Diese Methode wird oft mit Mehrwinkel-Lichtstreudetektoren (MALS) gekoppelt, um die Molekülmassen der eluierenden Komponenten absolut zu messen und so Robustheit und Informationsgehalt der Experimente zu optimieren. Die Hauptnachteile der Größenausschlusschromatographie liegen jedoch in der Veränderung der Aggregate durch Verdünnung, Scherung und Interaktion mit der stationären Phase. Auch die Zeit, die pro Messung und für die Gleichgewichtseinstellung nach Wechsel der mobilen Phase erforderlich ist, macht die Verwendung der Größenausschlusschromatographie für ein Screening vieler Proteinlösungen problematisch.

Deshalb werden diese Studien immer öfter mit säulenfreien Methoden wie Asymmetrischer Feldflussfraktionierung (AF4) [2], Hohlfaser-Feldflussfraktionierung (HF5) [3] und Dynamischer Lichtstreuung (DLS) durchgeführt. Dynamische Lichtstreuung bietet im Vergleich zu anderen Methoden die Möglichkeit, Messungen automatisiert und sehr schnell sowie mit geringem Bedarf an Probe in einem Well-Plate durchzuführen. Sie ist daher „High-Throughput“-fähig. Des Weiteren wird die Probe nicht verdünnt und keinen Scherkräften ausgesetzt, was eine mögliche Veränderung durch diese Effekte verhindert. Mittels DLS lassen sich für die Formulierung wichtige Parameter bestimmen, so die Viskosität, die Aggregation, die Löslichkeit sowie die Dissoziationskonstante.

Dynamische Lichtstreuung

DLS-Detektoren messen die zeitabhängige Fluktuation der Streulichtintensität, die durch die Brown‘sche Molekularbewegung verursacht wird (s. Abb. 2). Große Moleküle bewegen sich langsamer durch die Lösung als kleine. Durch die Messung der Fluktuationsänderung (s. Abb. 3) kann die Diffusionskonstante und mithilfe der Stokes-Einstein-Beziehung die Teilchengröße gemessen werden.

Die Messung der Streulichtmenge wird mit einer Avalanche-Photodiode durchgeführt. Diese Diode stellt die für die Dynamische Lichtstreuung erforderliche hohe zeitliche Auflösung von einigen 100 ns zur Verfügung. Die Auswertung erfolgt in einem Autokorrelator, einem Prozessor, der die zeitliche Änderung der Streulichtmenge auswertet. Je größer das Molekül, d.h. je langsamer es diffundiert, desto später tritt das Signal in der Autokorrelationsfunktion (s. Abb. 4) auf.

Der Parameter, der mittels DLS gemessen wird, ist der Diffusionskoeffizient (DT), aus dem der hydrodynamische Radius (Rh) unter Verwendung der Stokes-Einstein-Gleichung berechnet wird. Der hydrodynamische Radius Rh ist der Radius einer Kugel mit dem gleichen Diffusionskoeffizienten wie das gemessene Protein. Daher wird der hydrodynamische Radius auch als Kugeläquivalent-Radius bezeichnet. Die Detektionsgrenzen des hydrodynamischen Radius liegen zwischen 0,3 nm und 1 µm, wobei die untere Grenze durch die im Puffer verwendeten Salze gegeben ist. Die obere Grenze ergibt sich aus der Gravität. Weil die Intensität des Streulichtes proportional zur Molekülmasse ist, ist die Methode hoch empfindlich bei der Detektion kleiner Mengen großer Aggregate.

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