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Dynamische Lichtstreuung

Der Weg zur perfekten Formulierung

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DLS-Messungen

Moderne Proteinpräparate sind hoch konzentriert und enthalten bis zu 200 mg/mL Protein [6]. Dies bedeutet besondere Herausforderungen für die Analysemethode, da die hohe Konzentration die Viskosität erhöht. Die Viskosität der Proteinlösung muss bei solchen Lösungen bekannt sein, um den hydrodynamischen Radius zu bestimmen. Automatisierte DLS ist ein Verfahren, das die Viskosität dieser Lösungen mittels „tracer particles“ bestimmen kann [7].

Lehermayr et al. [8] konnten zeigen, dass mittels Radien-Messung mit automatisierter DLS auch die Dissoziationskonstante kD, und der zweite Virial-Koeffizienten A2 der Formulierung messbar sind. Die Vorteile der Bestimmung dieser Parameter mittels automatisierter DLS liegen im hohen Automatisierungsgrad, der Geschwindigkeit und der niedrigen benötigten Substanzmenge.

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Für die hier vorgestellten Messungen wurde der Wyatt Dynapro Plate Reader eingesetzt. Gemessen wurde in einer 384-Well-Plate. Hierbei handelt es sich um eine industrielle Standardplatte für Plate Reader mit optischen Messmethoden, in der mit einem Volumen von 20 µL pro Kavität gearbeitet wird. Verwendbar sind ebenfalls Well-Plates mit 96 oder 1536 Kavitäten, Standardplatten ebenso wie Low-Volume-Well-Plates. Die Kavitäten werden nur einmal gefüllt, sodass keine Verschleppung (Kreuzkontamination) von Probe auftreten kann.

Bei der hier vorgestellten Probe handelt es sich um einen monoklonalen Antikörper. Die Messungen wurden mit Konzentrationen von 3 bis 10 mg/mL durchgeführt. Als „tracer particles“ für die Messung der Viskosität dienten Polystyrolpartikel mit 50 nm Radius. Da direkt in dem Well-Plate gemessen wird, muss die Probe nicht während des Messvorgangs transportiert werden. Es ist kein Spülen oder Reinigen von Kapillaren und Küvetten erforderlich. Daher entfallen Wartezeiten, die beim Reinigen und manuellen Beschicken von Küvetten auftreten. Durch die so gewonnene Zeit ist es möglich, mehr Proben, die gleiche Probe mehrmals oder auch den reinen Puffer zu messen. Messungen der reinen Polystyrolpartikel ergeben einen hydrodynamischen Radius (Rh) von 50 nm (s. Abb. 5). Bei der Messung der Proteinlösungen erhält man durch den Einfluss der Viskosität der Proteinkonzentrationen Teilchengrößen von 50 bis 63 nm. Aus dem Verhältnis zwischen der erwarteten Teilchengröße und der gemessenen Größe kann somit die tatsächliche Viskosität aus der Stokes-Einstein-Beziehung errechnet werden.

Misst man den hydrodynamischen Radius der reinen Antikörperverdünnungsreihe, so kann man für jede Konzentration die jeweilige Viskosität einsetzen und erhält so die Werte für den hydrodynamischen Radius (s. Abb. 6, laborpraxis.de).

Yadav et al. [9] zeigen, dass man aus der Konzentrationsabhängigkeit des Diffusionskoeffizienten (kD) die Dissoziationskonstante des Proteins messen kann: Dm = Ds + Ds kD C

Hierbei ist Dm der gemessene Diffusionskoeffizient bei verschiedenen Konzentrationen und Ds ist der Diffusionskoeffizient der Probe bei der Konzentration C = 0 mg/ml.

Aus der Steigung ( 2,39*10-8 m2/s) ergibt sich eine Dissoziationskonstante kD von (0,35 mL/g). Aus dieser lässt sich nach Lehermayer et al. mittels folgender Formel der zweite Virialkoeffizient A2 bestimmen: kD = 1,06 A2Mw - 8,9

Hierbei ist Mw die molare Masse des gemessenen Protein-Monomers. Es ergibt sich somit ein A2 von (5,58e-5 mol mL/g2) für den gemessenen Antikörper.

Zusammenfassung

Direkte Messungen für die Viskosität und Messmethoden für die Messung des zweiten Virial-Koeffizienten bedeuteten bisher immer einen hohen Einsatz von Probe und Zeit. Mit der vorgestellten automatisierten Methode ist es möglich, die Messungen in Well-Plates in einer Zeit unter einer Stunde inklusive Pipettieren bei den acht gezeigten Konzentrationen durchzuführen. Hierzu wurden weniger als 100 µL der Antikörperstammlösung mit einer Konzentration von 100 mg/mL verwendet. Dies ist deutlich weniger Probe als die bisher mit traditionellen Messverfahren für die Bestimmung von Viskosität, Aggregation, Löslichkeit und Dissoziationskonstante erforderlich war. Die Messung kann auch in einem 1536-Well-Plate durchgeführt werden. Hierbei kann man das Probenvolumen auf eine Minimalmenge von 1,5 µl je Kavität und damit um ungefähr den Faktor 30 reduzieren. ●

Literatur

[1] www.vfa-bio.de/download/bcg-report-2011-broschuere.pdf.

[2] Litzen A., Wahlund K.G., J. Chromatogr., 1989, 476, 413-421

[3] Johann C., Elsenberg S., Roesch U., Rambaldi D.C., Zattoni A., Reschiglian P., J. Chromatogr., A, 2010, 1016

[4] Wyatt P.J., Instrumentation Science & Technology, 1997, 25(1), 1-18.

[5] Cromwell M.E.M., Hilario E., Jacobson F., The AAPS Journal, 2006, 8(3), E571-579

[6] Harding J, Burtness B., Drugs of Today, 2005, 41(2), 107-127

[7] Feng He, Journal of Pharmaceutical Sciences, 2011, 100(4), 1330-1340.

[8] Lehermayr C., Mahler H.C., Mäder K., Fischer S., J. Pharm. Sci., 2011, 100(7), 2551 2562

[9] Yadav S., Liu J., Shire S.J., Kalonia D.S., J. Pharm. Sci., 2010, 99(3), 1152-1168

* Dr. D. Roessner, Dr. R. Scherrers sind Mitarbeiter der Wyatt Technology Europe, 56307 Dernbach

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