Zweidimensionale Flüssigchromatographie (2D-LC) Die nächste Dimension der chromatographischen Trennung

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Praxisbeispiele für die 2D-LC gibt es viele: So lassen sich beispielsweise Entsalzungsschritte in die Trennung einbinden oder gleichzeitig Hauptprodukt und mögliche Verunreinigungen in nur einem Analysengang quantifizieren. Erfahren Sie, welches Potenzial in dieser kombinierten Trennmethode sonst noch steckt.

Schaut man sich die Entwicklung der Laborabläufe in den vergangenen Jahren an, ist klar zu erkennen, dass die Proben komplexer werden, die Anforderungen an die Probenvorbereitung steigen sowie die Behörden immer detailliertere Information über die Produkte anfordern. Hier kann die zweidimensionale Flüssigchromatographie (2D-LC) in vielfältiger Weise helfen:

• Auflösung schwer zu trennender Komponenten: Unvollständig getrennte Komponenten erfordern i.d.R. eine zeitintensive Methodenentwicklung mit ungewissem Ausgang. 2D-LC ermöglicht oft schnell, mit der bestehenden Methode, eine Trennung der nicht getrennten Signale.

• Chirale Trennungen inklusive: Zur Trennung chiraler Komponenten in einem Gemisch ist es i.d.R. erforderlich, die Komponente von allen anderem abzutrennen, zu sammeln und anschließend mit einer zusätzlichen chiralen LC-Analyse zu charakterisieren. 2D-LC kann beides in einer Analyse erledigen, indem sie die chirale Komponente ausschneidet und diese chiral in der zweiten Dimension trennt.

• Entsalzung für direkte MS-Kopplung: Viele LC-Trennungen in einem biopharmazeutischen Labor können aufgrund hoher Salzfrachten in der mobilen Phase nicht direkt an ein Massenspektrometer (MS) gekoppelt werden. 2D-LC ermöglicht hier oft eine direkte Kopplung durch Entsalzung in der zweiten Dimension, ohne dass die bestehende Methode angepasst werden muss.

Die drei Übergabevarianten der 2D-LC

Ein 2D-LC-Instrument kann man sich vorstellen wie zwei miteinander verbundene LC-Instrumente. Dabei ist das Instrument der ersten Dimension (¹D) ein Standard-LC-Instrument, bestehend aus Pumpe, Probengeber, Säule und einem meist optischen Detektor (s. Abb. 2). Die zweite Dimension (²D) besteht aus einer schnellen Pumpe, einem speziellen 2D-LC-Ventil, einer Säule und einem Detektor, meist ein UV-Detektor oder ein Massenspektrometer. Dieser Aufbau entspricht der Agilent Infinity Lab 2D-LC Solution und ermöglicht es, nahezu jeden LC-Turm von Agilent zu einer 2D-LC zu erweitern.

Spezielle 2D-LC-Ventile und symmetrische Flusspfade ermöglichen dabei höchste Reproduzierbarkeit der Retentionszeiten und Peakflächen. Das Herzstück des 2D-LC-Instruments ist das 2D-LC-Ventil. Es erlaubt den Transfer bzw. die Übergabe des Eluenten mit nicht oder nur teilweise getrennten Komponenten aus der ersten in die zweite Dimension. Dabei kann man grundsätzlich drei verschiedene Übergabevarianten unterscheiden:

1) SHC/MHC: Die einfachste Variante ist der so genannte Single- (SHC) oder Multiple-Heart-Cutting-Ansatz (MHC). Hierbei werden, wie in Abbildung 3 (oben) dargestellt, ein oder mehrere Bereiche aus der ersten Dimension in Probenschleifen geparkt und anschließend in der zweiten Dimension analysiert. Dieser Ansatz eignet sich besonders für noch unvollständig getrennte Signale oder für einen Entsalzungsschritt vor der Weitergabe ans MS.

2) LCxLC: Beim Comprehensive (LCxLC) Ansatz wird der komplette Eluent der ersten Dimension in gleichmäßigen Fraktionen in die zweite Dimension übergeben (s. Abb. 3, Mitte). LCxLC eignet sich besonders für die Charakterisierung komplexer Proben wie Polymer- und Blutproben sowie für Produkte der traditionellen chinesischen Medizin.

3) High-Res.: Ein Spezialfall des Multiple-Heart-Cutting-Ansatzes ist das High Resolution Sampling (High-Res). Es wird auch als selektive Comprehensive 2D-LC bezeichnet. Wie in Abbildung 3 (unten) gezeigt, wird dabei ein Abschnitt in mehrere kleine Bereiche unterteilt, die dann in die zweite Dimension übergeben werden. Durch die vollständige Übergabe eines Bereiches in die zweite Dimension ist es möglich, ko-eluierende Substanzen zu quantifizieren.

Um Ihnen die Möglichkeiten der 2D-LC näher zu bringen, stellen wir Ihnen im Folgenden drei praktische Anwendungsbeispiele aus der Forschung vor.

1.) 2D-LC als automatisiertes Entsalzungstool [1]

Gerade bei der Analyse und Charakterisierung von pharmazeutisch genutzten Proteinen und Peptiden ist eine massenspektrometrische Detektion dringend nötig. Jedoch nutzen viele Trennmethoden in diesem Bereich hohe Salzfrachten oder nicht-flüchtige Komponenten in der mobilen Phase, welche nicht in ein MS gelangen sollten [2-3]. Um getrennte Substanzen aus diesen Methoden im MS zu analysieren, müsste man ohne 2D-LC diese Substanzen oder Fraktionen sammeln und entsalzen. Erst danach können sie massenspektrometrisch untersucht werden. Einfacher ist es, bei einem 2D-LC-Instrument die zweite Dimension zur automatischen Entsalzung zu verwenden. Damit lassen sich Substanzen aus einer nicht MS-gängigen Analyse ohne manuelle Schritte massenspektrometrisch untersuchen [3].

Betrachten wir dazu die Analyse des Hormons Glucagon, einem aus 29 Aminosäuren bestehenden Peptid. Es dient u.a. als Notfallmedikament bei niedrigem Blutzuckerspiegel (Hypoglykämie) [4]. Die von der US-Pharmakopöe (USP) vorgeschlagene Methode ist eine LC-UV-Analyse mit einem Kaliumphosphat-Puffer als mobile Phase. Kaliumphosphat verhindert in diesem Fall allerdings die direkte MS-Detektion. Hier hilft die 2D-LC: Nachdem die relevanten Substanzen in der ersten Dimension aus der bestehenden Analyse (USP-Methode) ausgeschieden sind, erfolgt in der zweiten Dimension der Entsalzungsschritt. So ist direkt im Anschluss eine MS-Charakterisierung möglich. Das Salz wird dabei durch ein Ventil direkt nach der Trennung, also vorm MS-Eingang, auf einer Umkehrphasensäule entfernt. Alle Vorgaben der USP-Vorschrift wie die Retentionszeitengenauigkeit, Tailing und Auflösung sind auch im 2D-LC-Ansatz erfüllt.

Zusammengefasst ermöglicht die 2D-LC also die MS-Charakterisierung von Substanzen aus einer nicht MS-gängigen LC-Trennung, ohne die ursprüngliche Methode in der ersten Dimension zu verändern.

2.) Charakterisierung eines Copolymers mit LCxLC [5]

Synthetische Polymere sind komplexe Mischungen, die eine Verteilung in Größe, Zusammensetzung und Kettenstruktur aufweisen. In einfachen Fällen besteht nur eine Verteilung in der Anzahl der Monomereinheiten, welche sich mit Größenausschluss-Chromatographie (SEC) auftrennen lässt. Besteht das Polymer aus unterschiedlichen Monomereinheiten, so ergibt sich eine Verteilung hinsichtlich der chemischen Zusammensetzung. Diese kann man mithilfe verschiedener Arten der Interaktionschromatographie analysieren. Zeigt ein Polymer allerdings mehr als eine Verteilung, ist die 2D-LC für eine vollständige Charakterisierung essenziell [6-9].

Ein Beispiel ist die Charakterisierung eines Styrol-Acrylnitril-Copolymers, das eine Verteilung hinsichtlich Größe und chemischer Zusammensetzung aufweist. Wie oben beschrieben, wurde zunächst Interaktionschromatographie genutzt, um in der ersten Dimension den Acrylonitril-Anteil abzutrennen. In der zweiten Dimension wurde dann SEC für die Größenverteilung eingesetzt. Abbildung 4 zeigt den resultierenden 3D-Plot der Comprehensive-2D-LC-Analyse. Dabei ist der Anteil an Acrylonitril auf der Abszisse und die Größenverteilung auf der Ordinate aufgetragen.

Zusammengefasst kann man sagen, dass eine komplette Charakterisierung eines Polymers, das eine Verteilung in mehr als einer Richtung zeigt, nur mit einer Comprehensive-2D-LC-Analyse möglich ist.

3.) High-Resolution Sampling für Biopharmazeutika [10]

Bei der Qualitätskontrolle eines pharmazeutischen Produktes müssen alle Verunreinigungen und Begleitstoffe angegeben werden, die einen Anteil von über 0,05% in Bezug auf die Hauptkomponente haben. Dies ist besonders herausfordernd, wenn sich die Verunreinigungen chemisch nur wenig vom Hauptwirkstoff unterscheiden und dadurch ko-eluieren. Dann verstecken sich die Signale der Verunreinigungen oft in einer Schulter im Hauptsignal, was eine Quantifizierung unmöglich macht.

Der High-Resolution-2D-LC-Ansatz kann dieses Trennproblem lösen. Dabei werden Hauptsignal und Verunreinigung vollständig in mehreren kleinen Schnitten von der ersten in die zweite Dimension übergeben. Die zweite Säule trennt beide Komponenten unabhängig von allen anderen Komponenten. So können die Einzelsignale der 2D-Chromatogramme pro Komponente addiert und damit reproduzierbar quantifiziert werden.

In der Beispielanwendung von Stephan & Krieger [10] wird dies an verschiedenen Isomeren von Chlordifluorbenzoesäure und deamidiertem Insulin gezeigt. Dies verdeutlicht, wie strukturell sehr ähnliche Komponenten, die eindimensional nicht trennbar sind, durch den Einsatz von 2D-LC quantifiziert werden können.

Höhere Kapazität ist nur die Spitze des Eisbergs

Der Einsatz von 2D-LC geht längst weit über die reine Erhöhung der Peakkapazität hinaus. Weil kommerzielle Instrument- und Software-Lösungen immer weiter verbreitet und verfügbar sind, setzt man mehrdimensionale LC mittlerweile, wie an den ausgewählten Beispielen oben beschrieben, in den unterschiedlichsten Bereichen ein.

Ob man damit nun manuelle Prozessschritte eliminiert oder chemisch ähnliche Produkte quantifiziert: 2D-LC wird in Zukunft in vielen Bereichen höheren Probendurchsatz und bessere sowie sicherere Messergebnisse und Analysen ermöglichen.

Literatur

[1] Krieger, S., 2017. 2D-LC as an Automated Desalting Tool for MSD Analysis [5991-8437EN]. Agilent Application Note, 1 September, p. 9.

[2] Luo, H. e. a., 2017. 2D-LC as an on-line desalting tool allowing peptide identification directly from MS unfriendly HPLC methods. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Issue Band 137, pp. 139-145.

[3] Petersson, P., Haselmann, K. & Buckenmaier, S., 2016. Multiple heart-cutting two dimensional liquid chromatography mass spectrometry: Towards real time determination of related impurities of bio-pharmaceuticals in sal based separation methods. Journal of Chromatography A, Volume 1468, pp. 95-101.

[4] Joshi, A. B., Rus, E. & Kirsch, L. E., 2000. The degradation pathways of glucagon in acid solutions. International Journal of Pharmaceuticals, Volume 203, pp. 115-125.

[5] Krieger, S., 2016. Characterization of Styrene-Acrylonitrile Copolymers Using Comprehensive 2D-LC [5991-6699]. Agilent Application Note, 1 April, p. 7.

[6] Jiang & al., e., 2005. Comprehensive two-dimensional liquid chromatography for the characterization of functional acrylate polymers. Journal of Chromatography A, Volume 1076, pp. 51-61.

[7] Im & al., e., 2009. Two-dimensional liquid chromatography analysis of syntetic polymers using fast size exclusion chromatography at high column temperature. Journal of Chromatography A, Volume 1216, pp. 4606-4610.

[8] Radke, 2014. Polymer Separation by Liquid Interaction Chromatography Principles - Prospects - Limitations..Journal of Chromatography A, Volume 1335, pp. 62-79.

[9] Schoenmakers & Aarnoutse, 2014. Multi-dimensional separation of polymers. Analytical Chemistry, Volume 86, pp. 6172-6179.

[10] Stephan, S. & Krieger, S., 2017. High-Resolution Sampling 2D-LC for Pharmaceutical Impurity Analysis [5991-8082EN]. Agilent Application Note, 1 June, p. 11.

* Dr. J. Meixner, Agilent Technologies Deutschland, 76337 Waldbronn

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