Automatisierte Mikrofluidik Einfacher zur hochauflösenden Bildgebung vieler Zellstrukturen

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Super-Resolution-Mikroskopie macht Anordnungen von Molekülen mit Nanometerpräzision sichtbar. Komplexe Multiplex-Experimente erfordern jedoch noch immer viele Stunden manueller Arbeit. Automatisierte Mikrofluidik vereinfacht diese Abläufe, erhöht die Reproduzierbarkeit und ebnet den Weg zur intelligeten Mikroskopie.

Über Jahrzehnte bestand eines der wichtigsten Ziele der Mikroskopie darin, eine immer höhere räumliche Auflösung zu erreichen. Moderne Super-Resolution-Mikroskopie (SRM) hat diese Grenze inzwischen bis auf etwa zehn Nanometer verschoben. Damit lassen sich nanoskalige Strukturen und die Organisation von Proteinen sichtbar machen, die mit konventioneller Lichtmikroskopie nicht aufgelöst werden können.

Von höherer Auflösung zu mehr biologischer Information

Biologische Systeme sind jedoch komplex. Eine Zelle enthält zahlreiche Organellen und Strukturen, die miteinander wechselwirken. Ihre räumliche Organisation ist eng mit der Zellfunktion verbunden. Deshalb möchten Forschende heute nicht nur einzelne Strukturen möglichst scharf abbilden, sondern möglichst viele Bestandteile einer Zelle oder eines Gewebes in ihrer räumlichen Beziehung zueinander untersuchen.

Die multiplexierte Super-Resolution-Mikroskopie wurde somit zu einem wichtigen Werkzeug der modernen biologischen Bildgebung. Gleichzeitig entsteht jedoch eine praktische Herausforderung: Je mehr Informationen aus einer Probe gewonnen werden sollen, desto komplexer werden die experimentellen Abläufe – und desto schwieriger lassen sich diese manuell durchführen.

DNA-PAINT ermöglicht molekulares Multiplexing

Bei der konventionellen Mehrfarben-Fluoreszenzmikroskopie werden unterschiedliche Strukturen mit Fluorophoren verschiedener Farben markiert. In der Praxis lässt sich jedoch nur eine begrenzte Zahl von Zielstrukturen zuverlässig voneinander unterscheiden. 

DNA-PAINT verfolgt einen anderen Ansatz: Kurze DNA-Sequenzen kodieren die Identität verschiedener Zielmoleküle. Komplementäre, fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden erzeugen anschließend die für die hochauflösende Bildgebung erforderlichen Signale. Entscheidend ist, dass verschiedene Zielstrukturen nacheinander mit demselben Fluoreszenzfarbstoff aufgenommen werden können. Damit lassen sich viele Einschränkungen der konventionellen Mehrfarben-Mikroskopie umgehen.

Beim sogenannten Exchange-PAINT werden fluoreszierende DNA-Sonden nacheinander in die Probe eingebracht und wieder entfernt. Auf diese Weise können zahlreiche Strukturen innerhalb derselben biologischen Probe sukzessive sichtbar gemacht werden. Somit bietet die Methode eine hohe Flexibilität für Multiplex-Experimente – allerdings wird die praktische Umsetzung mit zunehmender Zahl zu untersuchender Zielstrukturen immer aufwendiger.

Manuelle Arbeit wird zum Flaschenhals

Jede Exchange-PAINT-Aufnahmerunde umfasst die Zugabe der DNA-Sonden, die Bildaufnahme und mehrere Waschschritte. Ein Multiplex-Experiment erfordert daher zahlreiche Lösungswechsel und dauert typischerweise mehrere Stunden.

Werden diese Schritte manuell durchgeführt, erfordern sie kontinuierliche Aufmerksamkeit. Unterschiede beim Pipettieren, Waschen oder bei den Inkubationszeiten können die Reproduzierbarkeit und letztlich auch die Bildqualität beeinflussen. Gleichzeitig begrenzt die manuelle Durchführung den Probendurchsatz.

Hier zeigt sich eine grundsätzliche Herausforderung moderner Mikroskopie: Während die Bildgebungstechnologien immer leistungsfähiger werden, beruhen viele experimentelle Abläufe weiterhin auf manueller Probenhandhabung. Deren Automatisierung kann daher ebenso wichtig sein wie die Weiterentwicklung des Mikroskops selbst.

Mikrofluidik automatisiert den Imaging-Workflow

Um diesen Flaschenhals zu beseitigen, haben wir eine automatisierte Mikrofluidik-Plattform für die multiplexierte Super-Resolution-Mikroskopie entwickelt.

Anstatt die Imaging-Lösungen manuell auszutauschen, werden verschiedene Reagenzien über separate Fluidik-Kanäle zugeführt und softwaregesteuert in die Probenkammer eingebracht. Eine sanfte Druckluftsteuerung ermöglicht einen schnellen und reproduzierbaren Lösungswechsel bei gleichzeitig geringer Belastung der Probe und niedrigem Reagenzienverbrauch.

Anstatt die Imaging-Lösungen manuell auszutauschen, werden verschiedene Reagenzien über separate Fluidik-Kanäle zugeführt und softwaregesteuert in die Probenkammer eingebracht. Eine sanfte Druckluftsteuerung ermöglicht einen schnellen und reproduzierbaren Lösungswechsel bei gleichzeitig geringer Belastung der Probe und niedrigem Reagenzienverbrauch.

Das System wurde bewusst als modulares Zusatzsystem entwickelt und lässt sich mit bestehenden Mikroskopie-Plattformen kombinieren. Für komplexere Experimente können bei Bedarf zusätzliche Fluidik-Kanäle einfach ergänzt werden.

Für den Laboralltag ergeben sich daraus klare Vorteile: höhere Reproduzierbarkeit, weniger manuelle Arbeit, geringerer Reagenzienverbrauch und ein höherer Probendurchsatz. Vor allem können komplexe Imaging-Protokolle standardisiert ablaufen, ohne dass jeder einzelne Schritt manuell ausgeführt werden muss.

Eine besondere Herausforderung: empfindliche Herzmuskelzellen

Die Vorteile einer kontrollierten Flüssigkeitszufuhr werden besonders bei empfindlichen biologischen Proben deutlich.

Primäre Kardiomyozyten sind große Herzmuskelzellen, die teilweise nur schwach an der Oberfläche der Probenkammer haften. Wiederholtes manuelles Waschen kann die Zellen mechanisch belasten oder sogar von der Oberfläche ablösen. Für die multiplexierte Bildgebung muss dieselbe Zelle jedoch über mehrere aufeinanderfolgende Aufnahmezyklen stabil erhalten bleiben.

Die Mikrofluidik-Plattform erzeugt einen präzise kontrollierten und schonenden Flüssigkeitsstrom. Dadurch konnten DNA-PAINT-Lösungen wiederholt ausgetauscht werden, ohne die Kardiomyozyten während des Experiments zu beschädigen.

Mit diesem Ansatz ließen sich fünf verschiedene Zielstrukturen innerhalb einzelner Kardiomyozyten darstellen. Die resultierenden Super-Resolution-Aufnahmen zeigen die detaillierte nanoskalige Anordnung membranassoziierter Proteine innerhalb derselben Zelle. Gleichzeitig verdeutlichen die Ergebnisse, dass automatisierte Mikrofluidik komplexe Multiplex-Aufnahmen auch bei empfindlichen biologischen Proben ermöglicht.

Von automatisierter Fluidik zur automatisierten Mikroskopie

Die Möglichkeiten der mikrofluidischen Automatisierung reichen weit über den Austausch von DNA-Sonden hinaus.

Da das System softwaregesteuert arbeitet, lässt sich der Lösungswechsel direkt in die Bildaufnahme integrieren. Das Mikroskop könnte zunächst die erste fluoreszenzmarkierte Struktur aufnehmen und anschließend automatisch die Waschvorgänge und den Austausch der DNA-Sonde durchführen bevor die Bildaufnahme fortgesetzt wird.

Auf diese Weise lässt sich nicht nur ein einzelner Arbeitsschritt, sondern perspektivisch der gesamte experimentelle Workflow automatisieren. Komplexe Experimente, die heute eine kontinuierliche Betreuung durch erfahrene Anwender erfordern, könnten nach standardisierten Protokollen mit minimaler manueller Intervention ablaufen. Dadurch könnte multiplexierte Super-Resolution-Mikroskopie auch für Nicht-Spezialisten, Imaging Core Facilities und größere Studien leichter zugänglich werden.

Der nächste Schritt besteht darin, solche Workflows nicht nur zu automatisieren, sondern adaptiv zu gestalten. Während des Experiments gewonnene Bildinformationen könnten von der Software analysiert und genutzt werden, um den nächsten experimentellen Schritt festzulegen – etwa die Anpassung von Aufnahmeparametern, die Auswahl einer neuen Bildregion oder den gezielten Austausch einer Lösung.

Auf dem Weg zur intelligenten Mikroskopie

Eine vielversprechende Plattform für solche Workflows ist das in der Arbeitsgruppe von Prof. Jan Huisken entwickelte modulare Flamingo-Lichtblattmikroskop.

Flamingo wurde als portable Imaging-Plattform konzipiert, deren Optik, Hardware und Software an unterschiedliche experimentelle Anforderungen angepasst werden können. Die modulare Architektur bietet damit eine geeignete Grundlage, um automatisierte Fluidik mit Bildaufnahme und adaptiven Mikroskopie-Protokollen zu kombinieren.

Die langfristige Vision ist ein intelligentes Mikroskop, bei dem Bildgebung, Probenmanipulation und Datenanalyse nicht mehr als getrennte Schritte ablaufen. Stattdessen könnten während der Aufnahme gewonnene Informationen das Experiment in Echtzeit steuern – beispielsweise durch die Auswahl relevanter Bildbereiche, die Anpassung der Aufnahmeparameter oder das Auslösen eines Lösungswechsels.

Die Mikrofluidik spielt dabei eine wichtige Rolle: Sie ermöglicht dem Mikroskop nicht nur, eine Probe zu beobachten, sondern auch gezielt mit ihr zu interagieren und ihre Umgebung präzise zu kontrollieren.

Automatisierung über die Mikroskopie hinaus

Die gleichen Prinzipien lassen sich auch außerhalb der multiplexierten Fluoreszenzmikroskopie einsetzen. Experimente in der DNA-Nanotechnologie und molekularen Selbstorganisation erfordern häufig eine zeitlich präzise Zugabe und Entfernung molekularer Komponenten. Automatisierte Mikrofluidik kann diese Kontrolle übernehmen und gleichzeitig den Reagenzienverbrauch reduzieren sowie die Reproduzierbarkeit erhöhen.

Ähnliche Konzepte könnten auch für neue experimentelle Ansätze an der Schnittstelle zwischen Nanotechnologie und Quantenwissenschaften interessant sein, bei denen exakt kontrollierte chemische Umgebungen und automatisierte experimentelle Abläufe eine wichtige Rolle spielen.

Automatisierte Mikrofluidik ist damit weit mehr als eine Lösung für repetitives Pipettieren. Indem sie kontrollierte Probenmanipulation mit softwaregesteuerter Mikroskopie verbindet, wird sie zu einem wichtigen Baustein für eine neue Generation automatisierter und adaptiver experimenteller Plattformen.

Originalpublikation: Basak, S.; Chi-Vu, K.; Mougios, N.; Oleksiievets, N.; Pollack, Y.G.; Brandenburg, S.; Opazo, F.; Lehnart, S.E.; Enderlein, J.*; Tsukanov, R.*, “A versatile microfluidics platform for enhanced multi-target super-resolution microscopy”. ACS Nano, 20 (2026)