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SPECIAL PROBENVORBEREITUNG Flexible Methoden der Festphasenextraktion

Autor / Redakteur: UWE D. NEUE*, JEFFREY R. MAZZEO*, DIANE M. DIEHL*, CLAUDE MALLET*, ZILING LU* UND DIRK SIEVERS** / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Die Festphasenextraktion (Solid-Phase-Extraction, SPE) ist die am weitesten verbreitete Methode der Probenaufreinigung oder Probenanreicherung für die moderne Flüssigkeitschromatographie (UPLC, HPLC). Sie findet in nahezu allen Bereichen Anwendung, in denen chromatographische Analysetechniken eine Rolle spielen.

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Die Festphasenextraktion (Solid-Phase-Extraction, SPE) ist die am weitesten verbreitete Methode der Probenaufreinigung oder Probenanreicherung für die moderne Flüssigkeitschromatographie (UPLC, HPLC). Sie findet in nahezu allen Bereichen Anwendung, in denen chromatographische Analysetechniken eine Rolle spielen. Hierzu gehören beispielsweise die Analyse pharmazeutischer Wirkstoffe und Metaboliten in Blutproben oder – in der Umweltchemie – die Anreicherung von Analyten in der Wasseranalyik.

Bei der SPE werden die zu extrahierenden Komponenten auf speziellen Adsorbentien angereichert und anschließend mit einem Lösungsmittel eluiert. Durch Auswahl des Adsorbens (Festphasenmaterial) und eines geeigneten Elutionsmittels ist neben der Extraktion eine Abtrennung von Matrixbestandteilen möglich. Eine Vielfalt an chemisch modifizierten Silikaphasen (z.B. Reversed-Phase mit n-Alkyl-, Cyanopropyl-, Phenylgruppen etc.), die zur Extraktion eingesetzt werden können, deckt einen breiten Polaritätsbereich ab. Weitere Vorteile bietet die SPE durch einen geringen Lösungsmittelverbrauch gegenüber der Flüssig-Flüssig-Extraktion. Durch diese geringen Lösungsmittelvolumina erhält man eine höhere Aufkonzentrierung des Analyten als bei der LLE. Die Firma Waters verfügt über langjährige Erfahrungen mit der Festphasenextraktion, die bis auf die Entwicklung und Markteinführung der Sep-Pak-Materialien 1978 zurückreichen [1,2].

Das hydrophobe polymerbasierte Oasis-Sorbens [3], das infolge seiner chemischen Struktur auch von Wasser benetzt wird, legte 1996 den Grundstein für die Entwicklung weiterer spezifischer SPE-Sorbentien, die überlegene Ergebnisse für ein breites Anwendungsspektrum liefern. In diesem Artikel beschreiben wir die verschiedenen Oasis-Materialien und stellen einige der Anwendungsmöglichkeiten vor.

Übersicht der Familie der Oasis-Sorbentien

Die Oasis-Sorbentien (Abb. 1) basieren auf dem gemeinsamen Grundmaterial Oasis HLB, einem Copolymer aus Divinylbenzol und N-Vinylpyrrolidon. Es bildet die Grundlage sowohl für die beiden starken Ionenaustauscher Oasis MCX und Oasis MAX als auch für die beiden schwachen Ionenaustauscher Oasis WCX und Oasis WAX. Der starke Kationenaustauscher Oasis MCX, ein Material mit weiterhin stark hydrophoben Eigenschaften, entsteht durch partielle Sulfonierung. Der starke Anionenaustauscher Oasis MAX enthält ein quaternäres Amin und verfügt ebenfalls über weiterhin hydrophobe Eigenschaften.

Die schwachen Ionenaustauscher Oasis WCX und Oasis WAX ermöglichen darüber hinaus eine Veränderung der Ionenaustauscheigenschaften in Abhängigkeit des pH-Wertes. Sie erlauben nicht nur variable hydrophobe Wechselwirkungen sondern auch variable Ionenaustauschwechselwirkungen, die sich beide durch die Wahl der Waschlösungen beeinflussen lassen. Die komplementären Wechselwirkungsmechanismen der fünf Oasis-Packungsmaterialien bieten alle Voraussetzungen, um methodische Problemstellungen effizient zu bewältigen.

Einsatz verschiedener Materialien und Methodenwahl

Die Wahl des Packungsmaterials und der Methode erfolgt nach einem einfachen Schema (Abb. 2) in Abhängigkeit der zu analysierenden Probesubstanzen [4,5]. Handelt es sich um Basen, ist einer der beiden Kationenaustauscher die erste Wahl. Handelt es sich um Säuren, wird bevorzugt einer der beiden Anionenaustauscher eingesetzt. In allen anderen Fällen ist die Verwendung des lipophilen Oasis-HLB-Materials zweckmäßig. Im Falle der Ionenaustauscher kann ein weiterer Aspekt berücksichtigt werden: sind die Proben permanent geladen, verwendet man einen schwachen Ionenaustauscher, andernfalls wahlweise einen starken oder schwachen Ionenaustauscher. Alle Fallbeispiele basieren auf der Annahme, dass die Probe auf der Packung zurückgehalten werden soll. Ist dagegen die Retention der Verunreinigungen erwünscht, wird der umgekehrte Weg eingeschlagen. Die Probe wird dann auf der Kartusche nicht retardiert.

Beispiel einer Methodenoptimierung mit Oasis-Sorbentien

Waters hat für viele Problemstellungen optimale SPE-Methoden ausgearbeitet, wobei hier Beispiele beschrieben werden, die sich zur Analyse von Pharmaka in Blut oder Urin eignen. Der Ansatz ist, generische Methoden zu entwickeln, die auf einfache Weise gute Ergebnisse liefern. In den Fällen, in denen die Qualität der Probenvorbereitungsmethode die Qualität der gesamten Analyse bestimmt, muss die Methode allerdings gut ausgewählt und gegebenenfalls optimiert werden. Zahlreiche Beispiele sind in der Literatur beschrieben [4,5].

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Ein häufig auftretendes Problem bei der LC/MS-Analyse von Blutproben ist die Signalunterdrückung oder -verstärkung durch endogene Probenbestandteile. Optimierte Methoden zur effizienten Aufreinigung erzielen bessere Ergebnisse. In Abbildung 3 wurde die gleiche Probe mittels dreier verschiedener Verfahren aufgereinigt: einer Proteinfällung durch Zusatz von Acetonitril, einer einfachen Methode unter Verwendung von Oasis HLB und einer optimierten Methode unter Verwendung von Oasis MCX. Die HLB-Methode war nur darauf ausgelegt, Proteine, Salze, Zucker und andere polare Komponenten sowie Triglyceride und andere stark hydrophobe Substanzen aus der Blutprobe zu entfernen. Auf diese Weise erfolgt ein Schutz der LC-Säule, eine echte Probenaufreinigung erfolgt nicht.

Die MCX-Methode nutzt sowohl die hydrophoben Eigenschaften als auch die Ionenaustauscherfunktionalität des starken Kationenaustauschers Oasis MCX. In diesem Falle werden außer den mit der Oasis-HLB-Packung abgetrennten Substanzklassen zusätzlich auch saure und neutrale Verbindungen ausgewaschen. Die Probe ist folglich erheblich sauberer als nach Anwendung einer der beiden anderen Methoden, wie der Vergleich der drei Chromatogramme belegt. Im Falle der Proteinfällung ist das Probensignal mit den anderen Signalen trotz der recht spezifischen Detektion vergleichbar. Im Falle der einfachen Oasis-HLB-Methode verschwindet ein erheblicher Anteil des störenden Hintergrunds, doch sind klare Zeichen einer Ionenunterdrückung gegeben. Die dritte Methode auf Basis des Oasis-MCX-Materials erzielt dagegen eine fast vierfache Verstärkung des MS-Signals. Das Signal-Rausch-Verhältnis ist hier über eine Größenordnung besser als nach Durchführung der einfachen Proteinfällung.

Diese generell anwendbaren Methoden liefern in zahlreichen Fällen sofort akzeptable Ergebnisse. Selbstverständlich kann es auch vorkommen, dass weitere Verbesserungen notwendig sind. In diesen Fällen ist es empfehlenswert, ein probenspezifisches Methodenprotokoll zu erarbeiten. Auch dafür gibt es generelle Vorgehensweisen, von denen an dieser Stelle eine aufgezeigt werden soll. Nehmen wir an, dass die Probe eine basische Substanz ist. Sie wird dann im wässrigen Medium (z.B. Plasma oder Urin) unter sauren pH-Bedingungen auf Oasis MCX durch Ionenaustauschwechselwirkungen retardiert. Im ersten Schritt lassen sich folglich polare Verunreinigungen wie Proteine (die auf Grund ihrer Größe nicht in die Poren der Packung eindringen können), Salze und Zucker unter Zusatz von zehn Prozent Methanol auswaschen. Danach werden hydrophobere neutrale Interferenzen und saure Probesubstanzen unter weiterhin sauren pH-Bedingungen herausgewaschen. Was bleibt, sind basische Verbindungen, die ähnliche Eigenschaften wie der Analyt besitzen.

Auch diese Interferenzen lassen sich weiter einschränken (Abb. 4). In Vorexperimenten wurde gezeigt, dass die Zielverbindung, in diesem Fall Pindolol, auch unter alkalischen Bedingungen, d.h. ohne Ionenaustauschwechselwirkungen bis zu einem organischen Gehalt der Waschlösung von 40 Prozent Methanol durch Oasis MCX gebunden wird. Der Grund dafür liegt schlicht in den hydrophoben Wechselwirkungen zwischen Analyt und Trägermaterial. Folgerichtig lässt sich somit auch im Alkalischen mit bis zu 40 Prozent Methanol waschen, wodurch Basen mit höherer Polarität als die Zielverbindung eluieren. Die Beobachtung, dass Pindolol mit 80 Prozent Methanol vollständig eluiert, ermöglicht es, stärker hydrophobe Basen auf dem SPE-Träger zurückzulassen. Die fertige SPE-Methode verwendet eine Waschlösung von 30 Prozent Methanol und eine Elutionslösung von 90 Prozent Methanol, womit etwas zusätzlicher Spielraum gewonnen wird, der mögliche Ungenauigkeiten in der Analysenmethode elegant umgeht.

Die Aufreinigung zwitterionischer Probesubstanzen kann sowohl mit einem Kationenaustauscher als auch mit einem Anionenaustauscher durchgeführt werden. Die Kombination beider Methoden stellt dabei eine schnelle und einfache Variante mit sehr guten Ergebnissen dar. Die bei-den schwachen Ionenaustauscher ermöglichen die Aufarbeitung stark basischer Proben wie beispielsweise quaternäre Amine (Oasis WCX) und stark saurer Proben wie beispielsweise Sulfonsäuren (Oasis WAX). Weitere Methoden finden sich in der Literatur [4].

Fazit: Mit den derzeit verfügbaren Methoden der Festphasenextraktion lassen sich sehr viele Probleme effizient, elegant und schnell lösen. Der kurze Artikel konnte die Methoden grob anzeichnen, weiterführende Details sind in der Literatur verfügbar [4,5].

NACHGEFRAGT: WO LIEGEN DIE VORTEILE DER FESTPHASENEXTRAKTION?

Seit fast dreißig Jahren beschäftigt sich die Firma Waters mit der Entwicklung von Sorbentien für die SPE. Mario Hagemeier, Technical Support Specialist bei der Waters GmbH in Eschborn, erläutert die Vorteile der SPE und wie Waters seinen Kunden bei der Methodenentwicklung hilft.

LaborPraxis: Was ist das Besondere an Ihren Oasis-Sorbentien für die Festphasenextraktion?

Hagemeier: Der Hauptvorteil liegt in der großen Flexibilität bei der Suche nach individuellen Problemlösungen. Die Empfindlichkeit einer Analyse lässt sich deutlich erhöhen. Zudem kann die schnelle Chromatographie vereinfacht werden – ein sehr aktuelles Thema nach Einführung unserer Acquity-UPLC-Systeme. Die patentierte Oasis-Familie, 1996 erstmals vorgestellt, umfasst fünf Phasen, die alle eine zweidimensionale Trennoption bieten: in vier Fällen in Form einer Ionenaustauscher-Funktionalität. Es stehen Extraktionskartuschen, Extraktionsplatten (inkl. µElution) und On-line- Extraktionssäulen zur Verfügung, mit denen sich in den meisten Fällen individuelle Komplettlösungen schnell und einfach entwickeln lassen.

Es wäre zwar eine Übertreibung zu sagen, alles sei machbar, doch gibt es generische Protokolle für unsere Oasis-Sorbentien, die sich bei Bedarf leicht optimieren lassen. Je mehr über die Analyten und deren Herkunft bekannt ist, umso erfolgreicher ist die Methodenentwicklung. Wir stehen gerne mit Rat und Tat zur Verfügung.

LaborPraxis: Sie Helfen Ihren Kunden bei der Entwicklung neuer Methoden?

Hagemeier: Selbstverständlich, neben der schnellen Zugriffsmöglichkeit auf eine umfangreiche Applikationsdatenbank bieten wir telefonische Soforthilfe. Zudem veranstaltet unser Team Workshops, um applikative Fragen mit unseren Kunden in der Praxis zu bearbeiten. Ein eigener Schulungskurs befasstsich explizit mit dem Thema SPE. Eine Entscheidung für Oasis bedeutet stets auch eine Entscheidung für die Expertise von 30 Jahren Forschung im Bereich der Festphasenextraktion.

Literatur[1] P. D. McDonald, R. V. Vivilecchia, D. R. Lorenz, Australian Patent # 509,338 (1978)[2] P. D. McDonald, „Sample preparation made imple – new cartridges for rapid sample enrichment and purification“, 12th International Symposium on Chromatography, Baden-Baden, September 25-29, 1978[3] E.S.P. Bouvier, D. M. Martin, P. C. Iraneta, M. Capparella, Y.-F. Cheng, D. J. Phillips, LC-GC 15 (1997), 153-158[4] Waters Oasis-Broschüre 720000606DE[5] U. D. Neue, C. R. Mallet, Z. Lu, Y.-F. Cheng, J. R. Mazzeo, “Techniques for Sample Preparation Using Solid-Phase Extraction”, Handbook of Analytical Separations Vol. 4, pp. 73-90, I. D. Wilson ed., Elsevier Science, 2003

* Dr. U. D. Neue, Dr. J. R. Mazzeo, r. D. M. Diehl, Dr. C. Mallet, r. Z. Lu, Waters Corporation, Milford/USA** Dr. D. Sievers, Waters GmbH, 65760 Eschborn

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