KOPPLUNGSTECHNIKEN FT-ICR-MS - Analytische Kraft für Proteomics

FT-ICR MS ist wohl die effizienteste MS-Technologie, die für Proteomanalysen zur Verfügung steht. Mit detaillierten Informationen über das Proteom direkt aus dem enzymatischen Verdau, verringert FTICR die Zeit bis zum Resultat – ein Schüsselfaktor bei der F&E Kostensenkung der Pharmaforschung.

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FT-ICR MS ist wohl die effizienteste MS-Technologie, die für Proteomanalysen zur Verfügung steht. Mit detaillierten Informationen über das Proteom direkt aus dem enzymatischen Verdau, verringert FTICR die Zeit bis zum Resultat – ein Schüsselfaktor bei der F&E Kostensenkung der Pharma-forschung.

Als wichtige Analysenmethode im Proteomics-Labor, bietet die Massenspektrometrie (MS) mehr Information über Zusammensetzung und Struktur einer Substanz aus einer kleineren Probenmenge, als irgendeine andere analytische Technik. Besonders die Hochauflösungs-Fourier-Transform-Ion-Cyclotron-Resonanz Massenspektrometrie (FT-ICR MS), revolutioniert die Analyse von Proteinen, da sie eine 100fach höhere Massenauflösung und Genauigkeit besitzt, als andere MS-Methode.

Der Vorteil von FT-ICRDie meisten Massenanalysen beziehen sich auf eine nominale Massengenauigkeit von 1 Da, doch eine steigende Anzahl von Anwendungen erfordert eine größere Genauigkeit. Die Auflösung, definiert als Abstand zwischen den Peaks, steigt nicht linear mit ansteigendem spektrometrischem Auflösungsvermögen an, sondern erhöht sich schrittweise (Abb. 1). Peaks fast gleicher Masse können durch die extrem hohe Auflösung der FT-ICR aufgetrennt werden. Sie ist höchst flexibel und kann für einen breiten Bereich von analytischen und physikalischen Messungen verwendet werden.

FT-ICR MS Entwicklung

FT-ICR leitet sich von der Ionen Kernresonanz Spektrometrie ab, einer Theorie, die in den 30er Jahren des letzten Jahrhunderts entwickelt wurde, um die grundsätzlichen Eigenschaften eines Atoms zu studieren. Fouriers Umwandlungsmethoden wurden hierzu mit ICR durch Comisarow und Marshall in den späten 70ern angepasst und integriert. Diesem folgte sehr schnell das erste FT-ICR Gerät [1, 2]. Seit dieser Zeit, ist das Interesse an dieser Technik ständig gestiegen, aber die Erwartungen an die FT-ICR konnte nur durch den Fortschritt einer anderen Technologie, der Magnetentwicklung, realisiert werden.

Der Schlüssel zur Weiterentwicklung

Ein wesentliches Bauteil aller FT-ICR Geräte ist der Magnet. Das magnetische Feld, in Kombination mit einem elektrischen Feld, wird genutzt, um Ionen einzufangen und sie zu zwingen sich in kreisförmigen Bahnen innerhalb der Analysatoren-Zelle zu bewegen. Die Frequenz der Ionenrotation ist proportional zu Magnetfeld und Ionenmasse. Die Anwendung der Fourier Transformation in einem statischen, homogenen Feld wandelt die Frequenz in Massenwerte um. Wichtig: in diesem Prozess werden die Ionen nicht zerstört und können wiederholt analysiert werden, um die Sicherheit der Messergebnisse zu verbessern. Die FT-ICR MS Auflösung steigt mit der Kraft und der Homogenität des Magnetfeldes.

Diese Parameter sind sehr kritisch bei der Bestimmung der Leistungsfähigkeit des FT-ICR MS Gerätes. Ein stärker werdendes Magnetfeld verbessert auch sechs andere wichtige FT-ICR Parameter. Die höchste nicht verbundene Masse und die Scangeschwindigkeit steigen linear mit dem magnetischen Feld an, während die kinetische Energie der Ionen, die maximale Anzahl der eingefangenen Ionen, die Obermassengrenze und die Ionenfangzeit quadratisch mit steigendem Magnetfeld ansteigen. Diese grundsätzlichen Vorteile resultieren in Verbesserungen anderer FT-ICR Leistungsparameter, wie dem Signal-Rausch Verhältnis, dem dynamischen Bereich, der Massenauflösung, der Massengenauigkeit und der Massenselektivität für MS/MS.

Zur Verfügung stehende Magnete

Dauermagnete haben eine niedrige Feldstärke, welche die Leistung der FT-ICR begrenzt und werden deshalb selten eingesetzt. Elektromagnete haben eine Feldstärke von weniger als 2 Tesla (T), können aber erfolgreich bei Ionen, die ein niedriges „Masse zu Ladung“ Verhältnis haben, angewendet werden. Supraleitende Magnete haben Magnetfelder, die sich von 1,4 T in den 60ern bis 25 T im Jahr 2000 verbessert haben. (Um dies in Relation zu setzen: 1 T ist 20000 mal stärker, als das Magnetfeld der Erde). Die Fortschritte in der Entwicklung supraleitender Magnete, ermöglichten parallel dazu Verbesserungen in der FT-ICR MS Bestimmung. Ein weiterer Vorteil supraleitender Magnete liegt in ihrer solenoiden Struktur. Relativ weite innere Bohrungen von ungefähr 150-220 mm im Durchmesser verbessern den dynamischen Bereich, da mehr Ionen ohne Peakverzerrung eingefangen werden können.

FT-ICR MS in Proteomics

Einer der größten Vorzüge von FT-ICR MS ist die Vereinfachung des Protein/Peptid Identifikationsprozesses durch die Eliminierung einer vorausgehenden chromatographischen Proteintrennung. Die hohe Auflösung von FT-ICR erlaubt Forschern sehr kleine Unterschiede in der Masse zu detektieren und ermöglicht die Identifizierung von hunderten Peptiden direkt aus dem enzymatischen Verdau (Abb. 2). Diese Anwendung ist von besonderer Bedeutung für die Pharmazeutische Industrie, für die eine Verkürzung der Zeit bis zum Erhalt des Resultats die Forschungs- und Entwicklungskosten für potentielle neue Pharmaka reduzieren kann.

Genaue Massenmessungen von 1 ppm oder besser erlauben eine direkte Bestimmung von Elementstrukturen bei Molekülen bis zu 1 kDa und ein größerer dynamischer Bereich hilft kleine Unterschiede zwischen den Proteinen festzustellen - wie z.B. Proteinveränderungen hervorgerufen durch Post-Translations-Modifikationen. Im Gegensatz zu anderen MS-Techniken, bei denen erhöhte Sensitivität in einem Verlust des Auflösungsvermögens resultiert, sind bei FT-ICR MS diese Parameter unabhängig. FT-ICR MS ist eine effiziente Technik in der biologischen Forschung und ganz besonders in der Proteomics Forschung. Diese Technik öffnet die Tür zur Charaktersierung des Proteoms auf einer Ebene, die zuvor mit anderen Technologien nicht zu erreichen war. Dies schließt die Fähigkeit ein, seltene Proteine zu profilieren, wie z. B. Messenger beim „Cell Signaling“, die Identifikation von post-translations-Modifikationen, die Erkennung von Änderungen in Protein:Protein Wechselwirkungen und schließlich Analysen des Proteoms auf der Einzell-Ebene.

High End FT-ICR MS

Ein Vorreiter bei der Entwicklung von FT-ICR MS ist Alan G. Marshall, der die NSF National High Field FT-ICR MS Facility an der Florida State University in Tallahassee leitet. Das FT-ICR MS, das dort eingesetzt wird, basiert auf einem Oxford Instruments 9.4 T supraleitenden Magneten. Dieses Gerät ist normalerweise für Elektrospray-Ionisation konfiguriert und beinhaltet ein Mikroelektrospray-Frontend, eine Ionenakkumulation und eine Massenselektion außerhalb des Magneten. Außerdem bietet es drei Fragmentationstechniken zur ausgedehnten Strukturbestimmung.

Das Labor arbeitet auch mit einem 7 T System, das mit einer Mikroelektrospray Quelle ausgestattet und nur für hoch empfindliche biologische Analysen ausgelegt ist. Zusätzlich entwickelt das Labor jetzt stärkere Feldsysteme von 14.5 T und möglicherweise mehr in der Zukunft. Das Labor nutzt die Leistungsfähigkeit der FT-ICR MS Technik weiterhin, um die Ionenmolekular-Chemie zu untersuchen: zwei-dimensionale FT-ICR MS/MS, massenselektierte Ionen-Fluoreszenz, Identifizierung und strukturelle Analysen von biologischen sowie Umwelt-Proben und dem Festlegen von Protein:Protein Grenzflächen. Die Identifikation von Aminosäureresten auf der Kontaktoberfläche zwischen zwei Proteinen wird für das Studium der tumorsuppressiven Proteine verwendet, für Mutationen, die mit mehr als der Hälfte aller menschlichen Krebsarten assoziiert sind.

Das Labor untersucht auch Anwendungen der FT-ICR auf dem Feld der Forensik und petrochemischen Industrie, z.B. dort, wo sich die Möglichkeit zur direkten Bestimmung von Elementarzusammensetzungen in komplexen Verbindungen als außerordentlich wertvoll erweist. Die extrem hohe Massenauflösung eines FT-ICR MS wird in der Pharmazeutischen Industrie auch zur Identifizierung tausender Verbindungen in einer Probe ohne deren vorherige Trennung angewandt. Kombinierte Wirkstoffe werden gescreent, um gerade die Liganden auszuwählen und zu identifizieren, die am stärksten an ihren biologischen Rezeptor gebunden sind und demzufolge die besten Wirkstoff-Kandidaten darstellen.

Zusammenfassung

Einfache Anwendung und extrem hohe Auflösung machen das FT-ICR MS zu einer attraktiven Technik für die Protein Identifikation und Charakterisierung. Mit steigender Magnetfeldstärke werden schwierige Untersuchungen zur Routine. Fortlaufende Entwicklungen in der supraleitenden Magnettechnologie versprechen, dass das FT-ICR MS eine führende analytische Technologie in der Proteomics bleibt.

*Dr. A. Sowerby und Dr. W. Vine, Oxford Instruments Superconductivity, Tubney Woods, Abingdon, Oxfordshire, OX13 5QX, UK Übersetzung aus dem Englischen, Originalversion erschienen in NewDrugs 5/04, 2003, pp 26 - 27.

Literatur:[1]Comisarow M. and Marshall A. Chem. Phys. Lett. 25 282 (1974)[2]Marshall A., Comisarow M., and Parisod G., J. Chem Phys. 71. 4434 (1979)[3]van der Rest G., He F., Emmett M., Marshall A. and Gaskell S. J. Am. Soc. for Mass Spectr. 12, 288-295 2001.

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