Steroidhormon-Anreicherung aus Oberflächengewässern Hormone im Griff?

Hormone werden vielfach zu therapeutischen Zwecken eingesetzt. Nebeneffekt: Früher oder später gelangen sie auch in unsere Gewässer und können so als endokrine Disruptoren Mensch und Umwelt gefährden. Empfindliche Analytik ist daher gefragt. Die verfügbaren LC-MS/MS-Systeme sind jedoch für ein Direktinjektionsverfahren noch nicht sensitiv genug. Die Lösung heißt deshalb: gezielte Anreicherung. Hier am Beispiel von Steroidhormonen vorgestellt.

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IWW Rheinisch-Westfälisches Institut für Wasserforschung Gemeinützige GmbH

Hormone haben einen verantwortungsvollen Job: In unserem Körper regeln sie unzählige essenzielle Funktionen und das auch in minimaler Dosierung. Ihr Zusammenspiel im endokrinen System ist dabei sehr gut aufeinander abgestimmt, geringste Abweichungen können große Folgen haben. Sie verdienen daher zu Recht große Beachtung. Neben den Hormonen werden auch andere organische Spurenstoffe als potenzielle endokrine Disruptoren in die Umwelt eingetragen.

Potenzielle endokrine Disruptoren: Steroidhormone unter Beobachtung

Die Steroidhormone 17α-Ethinylestradiol (EE2), 17β-Estradiol (E2) und Estron (E1) aus der Gruppe der Östrogene sind endokrin wirksame Substanzen, welche über menschliche Ausscheidungen ins Abwasser gelangen und somit auch in Oberflächengewässer eingetragen werden [1]. Aufgrund ihrer endokrinen Eigenschaften wurden diese Stoffe in die Beobachtungsliste „Watch-List“, welche Teil des Artikels 8 der Richtlinie 2008/105/EG ist, aufgenommen.

Die Mitgliedstaaten der EU sind demnach seit 2015 dazu aufgefordert, im Rahmen einer Analyse der Gesamtwasserprobe (whole water sample) Daten zu sammeln, um eine zukünftige Priorisierung von Schadstoffen durch die Kommission zu unterstützen [2]. Derzeit ist jedoch keines der am Markt verfügbaren LC-MS/MS-Systeme in der Lage, die in der „Watch-List“ aufgeführten höchstzulässigen Nachweisgrenzen mittels Direktinjektion zu erreichen [3]. Die Notwendigkeit möglichst rasch ein robustes Verfahren zu etablieren, wird auch dadurch deutlich, dass sich im DIN-Normausschuss Wasserwesen (NAW) der Arbeitskreis 16 „LC-MS/MS-Verfahren“ mit genau diesen Parametern beschäftigt.

Im Rahmen eines Projekts wurden grundlegende Erkenntnisse gesammelt, um ein robustes, routinetaugliches Verfahren mittels Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction, SPE) zu etablieren, bei dem die
Bestimmung der Hormonkonzentration in der Gesamtwasserprobe
berücksichtigt wurde. Für die Optimierung des Verfahrens wurden verschiedene SPE-Materialien, unterschiedliche Methoden der Probenstabilisierung und die Lagerung von SPE-Kartuschen nach der Anreicherung untersucht. Zusätzlich erfolgten Experimente mithilfe der Flüssig-Flüssig-Extraktion.

Optimierung des Verfahrens

Bei der Optimierung wurde als Kenngröße die Wiederfindungsrate (WFR) betrachtet. In einem bestehenden Routineverfahren (SPE-LC-MS/MS) wird für die Hormonanalytik ein Wasservolumen von 1000 mL aufgearbeitet und auf 1000 µL Endvolumen aufkonzentriert. Die Messungen wurden an einem LC-MS/MS von Waters (Acquity-LC-System gekoppelt an ein TQD-Massenspektrometer) im ESI+ Modus durchgeführt. In den Tabellen 1, 2 und 3 (s. Bildergalerie) sind die optimierten Methodenparameter zusammengefasst.

Bildergalerie

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• SPE-Materialien: Bei der SPE-Anreicherung wurden folgende Materialien getestet: HLB (Waters; 6 mL/200 mg), Polar Plus (Avantor; 6 mL/1000 mg), Strata-XL (Phenomenex; 3 mL/200 mg) sowie ENV+ (Biotage; 3 mL/200 mg und 6 mL/100 mg). Die nachfolgenden Arbeitsschritte waren für alle Materialien gleich. Es wurde mit 2 x 2 mL Acetonitril und 2 x 2 mL UPLC-Wasser konditioniert. Die Anreicherung der Wasserprobe erfolgte mit einem Volumenstrom von 15 mL/min. Anschließend wurden die Kartuschen 40 min im Stickstoffstrom getrocknet und dann mit 5 x 2 mL Acetonitril eluiert. Aufkonzentriert bis zur Trockene wurde das organische Extrakt im Wasserbad bei 45 °C im Stickstoffstrom. Der Rückstand wurde mit 500 µL UPLC-Wasser und 500 µL Acetonitril resolvatisiert. Von jeder Probe wurde eine Dreifachbestimmung durchgeführt. In weiteren Versuchen wurden auch die SPE-Disks „HLB“ (High, Medium, Low), „C18“, „DVB“ und „One Pass“ von Horizon eingesetzt.

• Lagerung und Stabilisierung: Um eine Aussage über matrixbelastete Proben treffen zu können, wurden sowohl Trinkwasserproben als auch Oberflächenwasserproben (Ruhr) bearbeitet. Der Versuch erstreckte sich über eine Dauer von zwei Wochen, wobei die ersten Proben sofort aufgearbeitet und gemessen wurden, weitere Aufarbeitungen und Messungen wurden nach einer Woche und zwei Wochen Lagerung bei 4 bis 8 °C durchgeführt. Die Stabilisierung erfolgte durch 40 mg/L Natriumazid und durch Ansäuern (HCl, pH 2). Die SPE-Anreicherung erfolgte mittels HLB-Kartuschen (Waters; 6 mL/200 mg).

• Lagerung von getrockneten HLB-Kartuschen: In weiteren Versuchen wurde getestet, ob eine Unterbrechung bei der Aufarbeitung nach dem Trocknen der beladenen Kartusche möglich ist und wie sich die WFR bei verschiedenen Lagerungsbedingungen verändern. Ein Teil der Kartuschen wurde am selben Tag eluiert und gemessen, die übrigen Kartuschen wurden im Gefrierschrank a) bei -16 °C, b) im Abzug vor Sonnenlicht geschützt, bei Raumtemperatur (RT) und c) im Exsikkator unter Vakuum bei RT gelagert. Die weitere Aufarbeitung und Messung dieser Kartuschen erfolgte nach sieben bzw. nach vierzehn Tagen.

• Zugabe von Sediment: Weitere Experimente sollten zeigen, ob die WFR durch die Zugabe von Sediment beeinflusst wird. Dazu wurden 100 mL Trinkwasser mit 100 mg Sediment versetzt. Die Aufarbeitung erfolgte wie im Versuch SPE-Materialien mit HLB-Kartuschen.

• Flüssig-Flüssig-Extraktion (FFE): Für die FFE wurden 10 mL einer Wasserprobe (Analytkonzentration: 300 ng/10 mL) mit 3 x 2 mL Ethylacetat extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt und anschließend wie oben beschrieben zur Trockne eingeengt, der Rückstand wurde mit 1 mL Wasser/Acetonitril (50/50) gelöst, in ein Vial überführt und gemessen.

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