Laborwasserqualität beeinflusst die Proteinauftrennung

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Das Gel, das mit Reinstwasser hergestellt und behandelt wurde (Abbildung 1B, ebenso silbergefärbte Gele, die hier nicht abgebildet sind), zeigte nicht nur eine geringere Streifenbildung, sondern auch eine größere Anzahl von Spots, die besser im Gel verteilt waren. Es wurden 407 Proteinspots im Gel detektiert, das mit Reinstwasser verarbeitet wurde, während im Gel, das mit Flaschenwasser zubereitet wurde, nur 206 Spots gefunden wurden (s. Abb. 1C). Die Ergebnisse legen nahe, dass die Qualität des Wassers die Proteinauftrennung mittels 2D-Gelelektrophorese beeinflusst hat.

Ultrafilter vs. Membranfilter

Als Nächstes wurde Reinstwasser aus zwei Entnahmestellen verglichen, die mit verschiedenen Endfiltern – einem Ultrafilter und einem 0,22-µm-Membranfilter – ausgestattet waren. Reinstwasser mit einem Widerstand von 18,2 MΩ·cm und einem TOC von 5 ppb wurde aus einem Milli-Q-Advantage-A10-System entnommen, das mit Reinwasser aus einem Elix-3-UV-System gespeist wurde. Das Milli-Q-System war mit zwei Endfiltern ausgestattet – einem Ultrafilter (Biopak, Merck Millipore) und einem 0,22-µm-Membranfilter (Millipak, Merck Millipore). Der Ultrafilter findet in vielen Life-Science-Laboren Einsatz, da er Nukleasen effektiv aus Reinstwasser entfernt. Ein 0,22-µm-Membranfilter ist unter Umständen jedoch besser für Proteomanalysen geeignet, da er sehr geringe Anteile extrahierbarer Substanzen aufweist. Die Färbung mit Coomassie-Blau zeigt Streifenbildung im hohen MW- und basischen pH-Bereich des Gels, das mit Reinstwasser aus einem Ultrafilter hergestellt wurde (s. Abb. 2B, oberer rechter Teil der Gele). Die Spots waren bei Verwendung von Reinstwasser aus einem 0,22-µm-Membranfilter besser im Gel verteilt (s. Abb. 2B). Die höhere Auflösung benachbarter Spots und die gute Definition der Spots wurden durch das Densitogramm bestätigt (s. Abb. 2C). Zum Vergleich des Kontaminationsgrades von Reinstwasser aus einem Ultrafilter mit Wasser aus einem 0,22-µm-Membranfilter wurde eine HPLC-MS-Analyse durchgeführt.

Bei der Vorkonzentrierung wurde nur Wasser 60 Minuten durch die C18-Vorkonzentrierungssäule geleitet. Während dieser Zeit sammelten sich die organischen Verunreinigungen im Wasser am Kopf der Säule an. Während der Gradientenelution nahm die Menge an organischem Lösungsmittel, das durch die Säule floss allmählich zu, sodass die organischen Verunreinigungen aus der Säule eluiert wurden. Diese Verunreinigungen wurden durch den PDA-Detektor und das Massenspektrometer detektiert. Abbildung 3 zeigt eine deutlich größere Anzahl von Peaks im UV- und Massenchromatogramm von Wasser aus dem Ultrafilter als von Wasser aus dem Membranfilter. Daraus lässt sich schließen, dass der Ultrafilter die Quelle der organischen Verunreinigungen des Wassers war. Solche Verunreinigungen könnten die Qualität des Gels beeinträchtigen und schließlich zu einer schlechten Proteinauftrennung führen.

Zusammenfassung

Die Daten deuten darauf hin, dass die Quelle des Wassers, das bei der 2D-Gelelektrophorese eingesetzt wird, die Protein-Auftrennung beeinflusst. Eine starke ionische Kontamination durch Salze und geladene organische Partikel könnte die Ionenstärke der Puffer verändern und die Proteinmigration beeinflussen. Eine solche Kontamination könnte die Streifen in den mit Flaschenwasser zubereiteten Gelen verursacht haben. Extrahierbare Substanzen von Lagerungsbehältern oder bestimmten Aufbereitungskartuschen können ebenfalls zu einer schlechten Auftrennung führen, wie bei den mit Reinstwasser aus einem Ultrafilter zubereiteten Gelen zu beobachten war. Unter den Optionen, die hier vorgestellt wurden, wurde mit frisch zubereitetem Reinstwasser aus einem Wasseraufbereitungssystem mit einem 0,22-µm-Endfilter die beste Proteinauftrennung mittels 2D-Elektrophorese erzielt. n

* M. Tarun, S. Mabic: Merck Millipore, St Quentin-Yvelines/Frankreich

* *Dr. M. Schrader: Merck Millipore, 65824 Schwalbach

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