2D-Gelelektrophorese Laborwasserqualität beeinflusst die Proteinauftrennung

Die 2D-Gelelektrophorese ist nach wie vor eine der wichtigsten und am häufigsten eingesetzten Techniken in der Proteomforschung. Die Zubereitung hochwertiger Gele erfordert Reagenzien hoher Qualität, einschließlich des verwendeten Wassers.

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Shimadzu Deutschland GmbH

C3 Prozess- und Analysentechnik GmbH

Elementar Analysensysteme GmbH

Merck Millipore GmbH

Die 2D-Gelelektrophorese ist arbeitsintensiv, kostspielig und zeitaufwändig. Zudem können die Ergebnisse der 2D-Auftrennung durch die geringsten Variationen bei der Probenvorbereitung, der Elektrophorese, der Färbung und der Datenerfassung beeinträchtigt werden. Dies macht eine genaue Kontrolle und Überwachung der 2D-Gelelektrophorese enorm wichtig.

Einer der einfachsten Schritte zur Gewährleistung hochwertiger, reproduzierbarer 2D-Gele ist die Verwendung von Reagenzien und Wasser höchster Reinheit.

Flaschenwasser vs. frisch

Flaschenwasser und Wasseraufbereitungssysteme sind zwei gebräuchliche Quellen für Reinstwasser im Labor. Ein gut ausgelegtes Wasseraufbereitungssystem produziert Reinstwasser mit einem sehr geringen Gehalt an Ionen (Widerstand 18,2 MΩ·cm) und organischen Verbindungen (Gesamtgehalt an organisch gebundenem Kohlenstoff (TOC) weniger als 5 ppb). Wasser dieser Qualität wird durch die Kombination von Umkehrosmose (RO), Elektroentionisierung (EDI), Ionenaustauscherharzen, Aktivkohle und UV-Photooxidation erzeugt. Durch Endfilter an der Entnahmestelle des Wasseraufbereitungssystems wird das Reinstwasser auf die spezifischen Bedürfnisse des Labors abgestimmt. Beispiele für solche Filter sind Ultrafilter und 0,22-µm-Membranfilter. In einer Studie wurde nun der Einfluss des Reinstwassers auf die Qualität von 2D-Gelen untersucht.

Im ersten Schritt wurde steriles Flaschenwasser (Baxter) mit frisch zubereitetem Reinstwasser verglichen. Das Reinstwasser wurde von einem Milli-Q-Synthesis-System (Merck Millipore) mit einem internen Ultrafilter erzeugt. Dieses System produziert Reinstwasser mit einem Widerstand von 18,2 MΩ·cm und einem TOC von weniger als 10 ppb. Das System wurde mit Reinwasser aus einem Elix-System (Merck Millipore) gespeist, das mittels RO und EDI Reinwasser aus Leitungswasser erzeugt.

Für den Leistungsvergleich der beiden Wassertypen für die 2D-Gelelektrophorese wurden parallel 2D-Gele mit Proben aus E.-coli-Extrakten zubereitet (Versuchsschema siehe Abbildung 1A). Für die erste Dimension wurde ein Streifen mit einem linearen pH-Bereich von 3-10 verwendet. Die Auftrennung in der zweiten Dimension wurde in einem 12%igen SDS-Polyacrylamid-Gel durchgeführt. Die Proteine wurden mit Coomassie-Blau- oder Silber-Färbelösungen sichtbar gemacht. Coomassie-Blau ist die gebräuchlichste Färbelösung für Gele. Die Silber-Färbung ist mindestens 100 Mal empfindlicher und daher empfindlicher für die Auswirkungen von Verunreinigungen. Das Wasser der beiden unterschiedlichen Quellen wurde zur Herstellung der Rehydrierungs- und Äquilibrierungspuffer für die erste Dimension, des 12%igen SDS-Polyacrylamid-Gels und des Separationspuffers für die zweite Dimension sowie der Färbelösungen verwendet. Wie Abbildung 1B zeigt, wiesen die mit Flaschenwasser zubereiteten und verarbeiteten Gele eine stärkere Streifenbildung auf. Potenzielle Ursachen dafür sind u.a. eine nicht komplette oder übermäßige Fokussierung, Proteinüberladung, unzureichende Probenvorbereitung und schlechte Proteinsolubilisierung. Eine starke Kontamination des Wassers, das zur Vorbereitung der Probe, der Puffer und Gele verwendet wird, kann ebenfalls zur Streifenbildung beitragen. Salze und geladene organische Partikel führen beispielsweise zu einer schlechten Fokussierung und verursachen horizontale Streifen. Eine Kontamination des Wassers kann ebenfalls zu einer ungleichmäßigen oder nicht kompletten Polymerisation des Gels der zweiten Dimension und damit zu einer schlechten Auftrennung führen und vertikale Streifen verursachen.

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