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Laborautomation

LC-MS: Immunsuppressiva im Blut vollautomatisiert bestimmen

| Autor/ Redakteur: Dr. Klaus Bollig* / Dr. Ilka Ottleben

Die ideale Dosierung von Immunsuppressiva nach Organtransplan­tationen, ist von Patient zu Patient verschieden und hängt von vielen Faktoren ab. Die Blutspiegel der Medikamente müssen daher regelmäßig überwacht und angepasst werden. Derzeit Goldstandard für solche Messungen: die LC-MS/MS.

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Abb. 1: Struktur der Immunsuppressiva Cyclosporin-A (A), Everolimus (B), Sirolimus (C), Tacrolimus (D). Diese Immunsuppressiva werden häufig nach Organtransplantationen verabreicht – ihre Blutspiegel müssen regelmäßig überwacht werden.
Abb. 1: Struktur der Immunsuppressiva Cyclosporin-A (A), Everolimus (B), Sirolimus (C), Tacrolimus (D). Diese Immunsuppressiva werden häufig nach Organtransplantationen verabreicht – ihre Blutspiegel müssen regelmäßig überwacht werden.
(Bild: ©Alexander Raths - stock.adobe.com; Shimadzu Deutschland)

Die Transplantation eines Organs ist oft die letzte lebensrettende Option für schwerstkranke Patienten. Damit dieses Organ jedoch nicht vom Körper abgestoßen wird, müssen diese Patienten langfristig immunsuppressive Medikamente (s. Abb. 1) einnehmen. Dabei spielt die Dosierung der verwendeten Präparate eine entscheidende Rolle, um ihre volle Wirksamkeit zu gewährleisten, gleichzeitig aber auch um unerwünschte Nebenwirkungen zu vermeiden. So kann eine Unterdosierung schnell zu einer Abstoßung der transplantierten Organe führen, andererseits besteht die Gefahr einer ernsthaften Vergiftung durch Überdosierung der Wirkstoffe.

Immunsuppressiva ideal zu dosieren, ist dabei von Patient zu Patient verschieden und hängt von zahlreichen Faktoren ab, etwa von Alter, Geschlecht oder generellem Gesundheitszustand. Des Weiteren sind die individuellen genetischen Voraussetzungen zu beachten sowie mögliche Interferenzen mit anderen Präparaten, die parallel eingenommen werden. Viele der Faktoren und Lebenssituationen variieren zudem im zeitlichen Verlauf der Behandlung. Dadurch verändert sich gleichzeitig die Pharmakokinetik der Medikamente, sodass die Medikamentendosierung regelmäßig überwacht und individuell angepasst werden muss.

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Bei der therapeutischen Anpassung und der Überwachung von Medikamentenblutspiegeln spielt eine schnelle und zuverlässige Analytik eine wichtige Rolle. Gleichzeitig müssen die analytischen Methoden für die quantitative Erfassung der eingesetzten Immunsupressiva ausreichend empfindlich und selektiv sein.

Goldstandard zur Messung von Immunsuppressiva im Vollblut

Herkömmliche Analyse-Methoden zur Erfassung von immunsuppressiven Medikamenten im Blut basieren auf immunologischen Verfahren. Sie bieten eine schnelle und einfache Lösung, da hierbei häufig keine Trennung des Medikaments von der Matrix (z.B. Blut, Plasma oder Serum) durchgeführt wird. Solche Immunoassays sind jedoch unspezifisch und werden stark von Matrixeffekten beeinflusst. Die Anfälligkeit für Störsubstanzen kann unter Umständen zu falschen Ergebnissen führen, z.B. durch Kreuzreaktivitäten mit Matrixbestandteilen oder mit Metaboliten der eigentlichen Wirksubstanz.

Der Einsatz von Flüssigchromatographie gekoppelter Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) ist daher eine ideale Alternative und derzeit der Goldstandard bei der Messung von Immunsuppressiva. Bei dieser Methode werden Zielsubstanzen nach chromatographischer Trennung mithilfe der so genannten MRM-Analytik (Multi-Reaction-Monitoring) massenspektrometrisch untersucht. Hierbei werden die gesuchten Substanzen im Massenspektrometer selektiert, fragmentiert und i.d.R.mehrere spezifische Fragmente detektiert. Die Analytik hat dabei bezüglich der Selektivität für die gesuchten Verbindungen enorme Vorteile.

Hochempfindlich und vollautomatisiert

Daneben besitzt die LC-MS/MS-Analytik eine hohe Empfindlichkeit für die gesuchten Verbindungen. Komplette Chemikalien-Kit-Systeme zur Probenvorbereitung und anschließender massenspektrometrischer Analyse von Immunsuppressiva sind zudem seit einigen Jahren von verschiedenen Herstellern erhältlich.

Ein Nachteil in der LC-MS-Analytik bestand allerdings bislang darin, dass zur Probenvorbereitung und zur massenspektrometrischen Analyse gut geschultes Personal mit entsprechendem Fachwissen verfügbar sein muss. Auch mussten in der Vergangenheit verwendete Kit-Systeme, die Automatisierung der Probenvorbereitung und die anschließenden LC-MS-Messungen komplex aufeinander abgestimmt werden.

Die nachstehend gezeigte komplette Automatisierung der Probenvorbereitung mit direkter Kopplung der LC-MS/MS-Anlage vereinfacht viele der nötigen Arbeitsschritte der LC-MS/MS-Analyse von Immunsuppressiva und geht damit Hand in Hand mit den heutigen Anforderungen moderner Analysenlabore.

Methoden, Materialien und Probenvorbereitung

Die quantitative Untersuchung der Immunsuppressiva wurde mit Analysengeräten und dem Alsachim Dosimmune Kit von Shimadzu durchgeführt. Sowohl das Kit-System, das verwendete Probenvorbereitungsmodul CLAM-2000, als auch die zur Analyse verwendete LC-MS-Anlage (LC-System Nexera X2 und Massenspektrometer LCMS-8050) werden hierbei von einem einzigen Hersteller bereitgestellt. Das bietet den Vorteil, dass die einzelnen Komponenten bereits vor der Analyse ideal aufeinander abgestimmt sind und auch die Kopplung von Probenvorbereitung und die anschließende LC-MS-Analytik innerhalb eines Systems gewährleistet ist (s. Abb. 2). Kombiniert mit einer einzigen Software zur Gerätesteuerung sind solche Systeme schnell, kaum fehleranfällig und auch für das breit ausgebildete Personal klinischer Labore leicht zu bedienen.

Das Kit-System umfasst die Standardsubstanzen sowie die mit 13C isotopenmarkierten internen Standards der derzeit klassisch verwendeten Immunsuppressiva Everolimus, Sirolimus, Tacrolimus und Cyclosporin-A. Zudem sind die zur Extraktion und Analyse nötigen Chemikalien und Puffersysteme enthalten. Die analytische Leistung der Methode wird mithilfe von Vollblut-Kalibratoren und Vollblut-Qualitätskontrollproben (QC-Proben) überwacht.

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