LC-MS: Immunsuppressiva im Blut vollautomatisiert bestimmen

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Shimadzu Deutschland GmbH

Gerstel GmbH & Co. KG

Gesellschaft für Analysentechnik HLS

Die Vollblutprobenröhrchen werden zur Analyse in das Probenaufbereitungsmodul CLAM-2000 eingesetzt: 25 μl der Vollblut-Probe wird mit 12,5 μl des internen Standards und 175 μl der Extraktionspufferlösung gemischt. Anschließend wird dieser Mix 30 Sekunden lang geschüttelt und danach im Zeitraum von 1 Minute filtriert. Die extrahierte Probe wird automatisiert in den Probengeber des Nexera-X2-Systems transferiert und von dort aus ohne zusätzliche Verzögerung direkt injiziert.

LC-MS/MS-Messungen und Ergebnisse

Im LC-MS-System werden die Immunsuppressiva innerhalb von zwei Minuten auf einer Trap-Säule angereichert, chromatographisch aufgearbeitet und anschließend massenspektrometrisch analysiert (s. Abb. 3).

Bei der massenspektrometrischen Analyse der Verbindungen wurden jeweils die Ammoniumaddukte der jeweiligen Zielsubstanzen fragmentiert [M+NH₄]⁺ und ausgewählte, resultierende Fragmentionen (MRM-Übergänge) detektiert. Eine Tabelle zeigt die zur Quantifizierung verwendeten Fragment-Ionen (s. Tab. 1).

Die Methode ermöglicht Tacrolimus, Sirolimus, Everolimus und Cyclosporin-A in Vollblut-Proben zu quantifizieren. Eine etablierte Strategie hierfür ist die Verwendung eines mit Deuterium gelabelten internen Standards. In dieser automatisierten Vollblut-Analyse wurde zusätzlich eine ¹³C-Markierung der internen Standardsubstanzen für Tacrolimus, Sirolimus und Everolimus verwendet. Sie erhöht die Genauigkeit der Ergebnisse, sorgt für eine bessere Langzeitstabilität der Standards und vereinfacht die Korrektur von Matrixeffekten.

Die Immunsuppressiva wurden in einem linearen Bereich von 0,5 bis 40 ng/ml für Tacrolimus, Sirolimus und Everolimus gemessen, für das Cyclosporin-A wurde ein linearer Bereich von 5 bis 1500 ng/ml erfasst (s. Abb. 4). Die Linearität der ermittelten Kalibriergeraden lag für alle Analyten bei einem R² von über 0,998.

Das Limit der Quantifizierung (LOQ) in Vollblut lag bei 0,5 ng/ml für Tacrolimus, Sirolimus und Everolimus und 5ng/ml für Cyclosporin-A (s. Abb. 5). Alle LOQ-Level erzielten dabei Signal-zu-Rausch-Verhältnisse (S/N) von über 25. Die Kontrollproben zeigen zudem Wiederfindungsraten zwischen 85 und 115% für alle Analyten (s. Tab. 2).

Fazit

Die standardmäßige Analyse von Immunsuppressiva im Blut von Transplantationspatienten besitzt die höchsten Qualitätsanforderungen. Moderne LC-MS/MS-Analyseverfahren stellen mittlerweile den Goldstandard dieser Analytik dar und haben erhebliche Vorteile gegenüber bislang verwendeten Immunoassays. Allerdings ist die massenspektrometrische Analyse durchaus komplex und erfordert geschultes Laborpersonal.

Im Bereich des therapeutischen Drug Monitorings gibt es für die Massenspektrometrie derzeit nur wenige Komplettlösungen, die aus einer Hand angeboten werden. Dabei können vollautomatisierte Systeme, die idealerweise Kit-Systeme zur Probenaufarbeitung vom selben Hersteller mitliefern, die Etablierung und Durchführung einer Routineanalytik erheblich vereinfachen. Sie sind zudem weniger fehleranfällig. Der Bedarf nur einer einzigen Softwareplattform für die gesamte Analytik vereinfacht die Bedienung und erlaubt es auch weniger komplex geschultem Laborpersonal, die Analyse leicht durchzuführen.

* Dr. K. Bollig: Shimadzu Deutschland GmbH, 47269 Duisburg

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