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PCR-Analytik Neues Assay zur Analyse der Diagnoseresistenz

Autor / Redakteur: Olfert Landt* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Resistente Bakterien sind das Resultat des leichtfertigen Umgangs mit Antibiotika – bei der Behandlung von Patienten und dem prophylaktischen Einsatz in der Landwirtschaft. Fachleute befürchten, dass die Entwicklung neuer Wirkstoffe mit der Ausbreitung resistenter Erreger nicht Schritt halten kann. Somit könnte die Krankenversorgung in die Zeit vor der Entdeckung des Penicillins zurückgeworfen werden. Ein neues Testkit soll bei der Chalmydien-Detektion helfen.

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Die Meldung eines neuen Chlamydia-trachomatis-Stammes aus dem schwedischen Halmstad, sorgte Ende 2006 für großes Aufsehen [1-3]. Hierbei war die für die am weitesten verbreiteten molekularen Diagnostika erforderliche Zielsequenz verloren gegangen. Entdeckt wurde der Stamm durch einen unerklärlichen Rückgang der diagnostizierten Chlamydia-Infektionen. Erste Berichte sprachen von bis zu 50 Prozent deletierter Chlamydien. Das Ausmaß war jedoch weit weniger dramatisch, da es sich um eine lokal begrenzte Entwicklung handelte. In den benachbarten Ländern ließen sich nur einzelne Fälle nachweisen.

Chlamydien-Diagnostik

Chlamydien werden in erster Linie sexuell übertragen. Eine Infektion führt zu unterschiedlich ausgeprägten Krankheitsbildern. Während sie bei Männern manchmal ohne Symptome bleibt, gilt die Chlamydien-Infektion bei Frauen als häufigste Ursache für Unfruchtbarkeit. Der Gestezgeber hat daher beschlossen, jungen Frauen jährliche Tests auf Chlamydien als zusätzliche Regelleistung anzubieten [4]. Die für den spezifischen Genomnachweis von Bakterien bevorzugten ribosomalen 16S RNA-Sequenzen liegen bei Chlamydien nicht in mehreren Kopien vor. Die beliebteste Zielsequenz für den Chlamydia-trachomatis-Nachweis ist daher das kryptische Plasmid, das in einigen Kopien vorliegt und den PCR-Nachweis deutlich empfindlicher macht. In dem Chlamydia-trachomatis-Stamm aus Halmstad fehlte dieses DNA-Fragment, sodass die gängigen PCR-Tests zu einem falsch-negativen Ergebnis führten [5]. Für ein Versagen des Nachweissystems hätte bereits das Fehlen einer Primer-Bindungsstelle ausgereicht. Tib Molbiol entwarf im November 2006 ein LightCycler-Detektionssystem für den Deletions-Nachweis. Der Assay wurde kürzlich überarbeitet, sodass Wildtyp und Deletion jetzt mit der gleichen Sensitivität nachweisbar sind und auch gemischte Infektionen entdeckt werden können. Zudem erlaubt es der Test, die Verbreitung der neuen Variante gezielt zu untersuchen. Die von der Deletion betroffenen Nachweissysteme mussten modifiziert werden, um eine neue konservierte Zielsequenz nutzen zu können. Diagnostika-Anbieter, deren Nachweissysteme auf einer anderen bakteriellen Sequenz basieren, wie das von Tib Molbiol für Forschungszwecke bevorzugte Gen des MOMP-Membranproteins, konnten unverändert eingesetzt werden und die Lücke füllen.

PCR-Testkit

Es überrascht nicht, dass sich Mikroorganismen gegen ihren Nachweis wehren. Hersteller und Anwender müssen berücksichtigen, dass sich Zielstrukturen verändern können. Daher sollten alternative, evaluierte Testsysteme bereit stehen oder sogar parallel in der Routinediagnostik eingesetzt werden. Die Standardisierung von Verfahren macht die Diagnostik nicht per se sicherer und besser. So schränkt die erforderliche Zertifizierung der In-Vitro-Diagnostika eine Verbreitung der Home-Brew- oder In-House-Nachweisverfahren deutlich ein. Chlamydia trachomatis ist z.B. ein in Annex B aufgeführtes Pathogen mit besonderen Auflagen. Dementsprechend wird die Vielfalt der verwendeten Verfahren und Zielsequenzen immer kleiner. Es besteht die Gefahr, dass wie in der Landwirtschaft Monokulturen an Diagnostika entstehen, die eben auch anfälliger gegen Angriffe sind. Zum Nachweis eines Erregers sollten daher unterschiedliche Verfahren zur Verfügung stehen.

Literatur

[1] Ripa T, Nilsson P. A variant of Chlamydia trachomatis with deletion in cryptic plasmid: implications for use of PCR diagnostic tests. Euro Surveill. 2006 Nov 9;11(11).

[2] Genbank Sequenz: E061109.2

[3] Schachter J. The Chlamydia trachomatis plasmid deletion mutant-what does it mean to us? Sex Transm Dis. 2007 May;34(5):257.

[4] http://www.g-ba.de/downloads/34-215-195/2007-09-14-MVV-Chlamydien-Screening.pdf

[5] Ripa T, Nilsson PA. A Chlamydia trachomatis strain with a 377-bp deletion in the cryptic plasmid causing false-negative nucleic acid amplification tests. Sex Transm Dis. 2007 May;34(5):255-6.

*O. Landt, Tib Molbiol GmbH, 12103 Berlin

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