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Mikroplatten Optimierte Mikroplatte für die Lumineszenzmessung

| Autor / Redakteur: Stephen Knight* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Lumineszenzmessungen sind komfortabel durchführbar und zeichnen sich durch eine hohe Spezifität und Sensitivität aus. Lesen Sie, wie neu entwickelte Mikroplatten die Messung bei großen dynamischen Bereichen erleichtern, indem sie das optische Übersprechen zwischen einzelnen Vertiefungen minimieren.

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Abb. 1: Eine neu entwickelte Mikrotestplatte von Porvair Sciences kombiniert weiße Einzelvertiefungen mit einer Schwarzmatrix.
Abb. 1: Eine neu entwickelte Mikrotestplatte von Porvair Sciences kombiniert weiße Einzelvertiefungen mit einer Schwarzmatrix.
( Bild: Porvair Sciences )

Im Laufe der letzten zehn Jahre kamen im Bereich der Arzneimittelforschung immer mehr Lumineszenz-Analysen und -Reagenzstoffe zum Einsatz. Vor allem der Anwendungskomfort verbunden mit hoher Spezifität der Analysen und guter Sensitivität bei geringen Mengen der untersuchten Verbindungen machen die Lumineszenzmessung häufig zur Methode der Wahl. Mithilfe moderner photometrischer Instrumente lassen sich selbst geringfügigste Photonenemissionen aus Lumineszenzsubstraten akkurat ermitteln. Bei den verwendeten Mikrotestplatten nach SBS/ANSI-Standard muss daher insbesondere auf das optische Übersprechen und den experimentell ermittelbaren Signal-Rauschabstand geachtet werden.

Photometrische Verfahren

Es gibt drei grundlegende Verfahren, um aus Proben auf Mikrotestplatten-Basis nützliche optische Daten zu gewinnen. Das einfachste davon liegt in der Absorptionsmessung. Laut Lambert-Beer’schem Gesetz ist die Konzentration einer gegebenen Verbindung innerhalb einer Lösung direkt proportional zu den bei einer bestimmten Wellenlänge und einer konstanten optischen Weglänge absorbierten Lichtquanten. Somit kann ein Strahl monochromatischen Lichts in die Vertiefung geleitet und das übertragene oder absorbierte Licht gemessen werden. Anhand einer einfachen Berechnung lässt sich dann die relative Konzentration innerhalb jeder Vertiefung ermitteln. Bei der Mehrheit der in Laborumgebungen genutzten Mikrotestplatten-Reader findet dieses Verfahren Anwendung.

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Dort, wo eine höhere Sensitivität erforderlich ist, werden Fluoreszenzmessungen bevorzugt. In diesem Fall wird ein Anregungsstrahl einer bestimmten Wellenlänge in die Vertiefung geleitet. Das Fluorophor absorbiert Photonen aus dem Auflicht und reemitiert Photonen mit geringerer Energie, die konsequent in einer größeren Wellenlänge erscheinen. Innerhalb eines Fluorimeters können einfache Kantenfilter genutzt werden, um reflektierte Anregungswellenlängen aus dem erfassten Licht zu entfernen, sodass lediglich die Emissionswellenlänge zurückbleibt. Die Sensitivität ist hierbei zehnfach höher als bei einfachen Absorptionsmessungen. Eine noch höhere Sensitivität kann durch Verringerung der Bandbreite sowohl der Anregungs- als auch der Emissionswellenlängen mithilfe von Monochromatoren erzielt werden. Derartige Spektrofluorimeter ermöglichen eine Sensitivitätssteigerung einer anderen Größenordnung.

Bei dem dritten grundlegenden Verfahren handelt es sich um die Bio- bzw. Chemilumineszenz. Bei der Biolumineszenz handelt es sich um ein natürlich auftretendes Phänomen, das bei bestimmten Tier- und Pflanzenarten auftritt, die über einen von zwei geläufigen Mechanismen Licht ausstrahlen können – den Aequorin- und den Luziferin-Weg. Der Leuchtkäfer (Lampyridae), der Ruderfußkrebs (Metridia Longa) und die Seequalle (Renilla Reniformis) besitzen Enzyme der Klasse Luziferase, welche die Oxidation des Luziferin-Substrats mithilfe von ATP katalysieren und schließlich die Lichtausstrahlung ermöglichen. Bei Leuchtquallen der Familie Aequorea wird das Substrat Aequorin mittels Coelenterazin und Ca2+-Ionen angeregt. Bei der Rückkehr in den Grundzustand wird blaues Licht ausgesendet. Bei diesen Reaktionen handelt es sich um biologische Adaptationen eines Prozesses, die auch als rein chemisch gesteuerte Reaktionen angesehen werden können – in diesem Fall spricht man von Chemilumineszenz.

Durch Transfektion von Zellen mit einer generischen Konstruktion, die ein Luziferase-Gen enthält, kann Luziferase als Reporter zur Beurteilung der Transkriptionsaktivität innerhalb der Zellen oder zur Erstellung einer höchst sensitiven Analyse der zellularen ATP-Mengen genutzt werden, anhand derer beispielsweise die Zellapoptose im Rahmen von Screening-Anwendungen mit hohem Durchsatz ermittelt werden kann. Bei derartigen Analysen wird durch das geklonte Luziferase-Enzymsystem ein kontinuierliches Leuchten abgegeben. Dessen Kinetik kann untersucht und beispielsweise mit der Konzentration des vorhandenen ATP oder mit der Neigung einer Zelle verknüpft werden, infolge einer chemischen Stimulation eine Mitose durchzuführen, stabil zu bleiben oder den Zelltod auszulösen. Lumineszenz-Analysen dieser Art werden von verschiedenen führenden Life-Science-Unternehmen unter Namen wie AequoScreen, LucLite, ATPLite oder OneGlo vermarktet. Die Erkennung erfolgt in der Regel mithilfe eines Luminometers oder eines Multilabel-Lesegeräts, d.h. einem Mehrzweck-Spektrometer, welches im Absorptions-, Fluoreszenz- oder Lumineszenz-Modus lesen kann. Die drei optischen Erkennungsverfahren sind in Abbildung 2 schematisch dargestellt.

  • Seite 2: Prinzip der Porvair-Platten
  • Seite 3: Vergleichsergebnisse der Lumineszenzmessung

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