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Mehrwinkellichtstreuung

Peptid-Oligomere bei Insulinpräparaten mit Mehrwinkellichtstreuung detektieren

| Autor/ Redakteur: Per-Olof Wahlund* und Dierk Roessner** / Dr. Ilka Ottleben

Das Peptidhormon Insulin spielt im Körper eine zentrale Rolle u.a. bei der Regulation des Blutzuckerspiegels und des Stoffwechsels. Assoziationsphänomene sind häufig und müssen daher untersucht werden. Dabei hilft die Mehrwinkel-Lichtstreuungsmessung.

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Abb. 1: Der Detektor Wyatt Dawn Heleos kam bei der Studie zum Einsatz.
Abb. 1: Der Detektor Wyatt Dawn Heleos kam bei der Studie zum Einsatz.
(Bild: Wyatt)

Im Zuge der Analytik von Proteinen und Peptiden stellt sich bisweilen die Frage, ob die untersuchten Moleküle als Monomere vorliegen oder ob sie beispielsweise Dimere oder Aggregate höherer Ordnung gebildet haben. Ist das stöchiometrische Verhältnis zwischen den verschiedenen molekularen Erscheinungsformen bekannt, so lässt sich eine Aussage darüber treffen, ob das Protein in seiner biologisch aktiven Form vorhanden ist.

Der erste Schritt bei solchen Untersuchungen besteht in der Regel in der Trennung aller vorhandenen Molekülspezies, die dann nachfolgend charakterisiert werden. Das Mittel der Wahl ist dabei meist die Größen-Ausschlusschromatographie (SEC: size exclusion chromatography). Diese Methode trennt die Moleküle ihrem Volumen entsprechend. Da nun aber nicht allein die Masse eines Moleküls über sein Elutionsverhalten entscheidet, sondern auch seine hydrodynamischen Eigenschaften dabei eine Rolle spielen, kann man die Molmasse eben nicht verlässlich nur anhand der Elutionszeit ermitteln.

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Absolute Molmassen mit Mehrwinkellichtstreuung bestimmen

Diese Schwierigkeiten kann man durch die Nutzung der MALS-Technologie umgehen (MALS: multi angle light scattering, Mehrwinkel-Lichtstreuung). MALS misst Molmassen absolut. Dies bedeutet, dass die Methode allein aufgrund physikalischer Gesetze, also so genannter „first principles“, arbeitet. Annahmen zur Gestalt und Struktur der Moleküle sind ebenso unnötig wie der Gebrauch von Standards. Neben der Molmasse ergibt sich bei der Messung auch der Gyrationsradius (Rg) der Moleküle. Bei Bedarf lässt sich diese Art der Messung zusätzlich mithilfe dynamischer Lichtstreuung (DLS) ergänzen und so außerdem der hydrodynamische Radius (Rh) einer Probe bestimmen.

In diesem Beitrag werden Untersuchungen an dem Peptidhormon Insulin vorgestellt. Insulin spielt im Körper eine zentrale Rolle bei der Regulation des Blutzuckerspiegels und des Stoffwechsels. Auch für Zellwachstum und Fetthaushalt ist Insulin von großer Bedeutung. Damit sind allerdings nur einige der vielfältigen Funktionen dieses Botenstoffes genannt. Die Entdeckung des Insulins im Jahre 1921 markierte den Beginn einer Revolution in der Behandlung des Diabetes mellitus beim Menschen. Human-Insulin ist ein Protein, das sich aus zwei Peptidketten von 21 bzw. 30 Aminosäuren Länge zusammensetzt. Seine Molmasse beträgt insgesamt 5,8 kDa. In der Anwesenheit von Zink-Ionen bildet Insulin einen Hexamer-Komplex, in dem zwei Zn-Ionen gebunden sind. Komplexiert mit diesem Metall wird Insulin auch in den Beta-Zellen des Pankreas eingelagert.

Ist das Insulin Bestandteil von pharmazeutischen Produkten, wird es so hoch konzentriert, dass es zu einer verstärkten Selbstassoziation kommt. Daher wird diesen Formulierungen auch Zink zugesetzt, damit die Bildung von Hexameren erleichtert und der gesamte Ansatz dadurch stabilisiert wird. Nach der Gabe erfolgt eine starke Verdünnung des Präparates im Blutstrom, und daraufhin dissoziiert der Komplex in die physiologisch aktiven Monomere, die dann im Organismus ihre angestammte Wirkung entfalten können.

Daher ist es aus pharmakologischer Sicht von großem Interesse zu untersuchen, wie der Prozess der Oligomerbildung in einer Insulin-Präparation vonstatten geht.

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