Peptid-Oligomere bei Insulinpräparaten mit Mehrwinkellichtstreuung detektieren

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Material und Methoden der Peptid-Oligomer-Analyse

Als HPLC-Instrument wurde ein Agilent 1260 System benutzt. Es bestand aus einem Autosampler, einer isokratischen Pumpe und einem Entgaser. Die Trennsäule war eine Superose 12 300/10 (GE Healthcare). Als Detektoren dienten ein Multi-Wellenlängen-Detektor (Agilent) bei 280 nm, ein Dawn-Heleos-18-Winkel-Lichtstreudetektor mit QELS für die DLS-Messung sowie ein Optilab-rEX-RI-Detektor von Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, USA.

Die mobile Phase bestand aus 10 mM Tris, 140 mM NaCl, 2 mM Phenol und 200 ppm NaN₃ bei pH = 7,7.

Analysiert wurden drei verschiedene Insulinpräparationen, die alle 0,6 mM Insulin enthielten:

• Probe 1: Insulin-Analogon ohne Zugabe von Zink,

• Probe 2: Human-Insulin mit 0,1 mM Zink sowie

• Probe 3: Human-Insulin mit 0,3 mM Zink.

Ergebnisse und Diskussion

Die so genannte Selbstassoziation, eine reversible Zusammenballung von Proteinmolekülen, wie sie besonders bei hochkonzentrierten Lösungen vorkommt, ist ein bekanntes Phänomen für Proteine wie etwa monoklonale Antikörper oder Insulin. Im Falle des Insulins bilden die Moleküle Dimere und andere Oligomere, die sich mittels SEC auftrennen und durch Lichtstreuungsmessung (LS-Messung) detektieren lassen. Nachfolgend wird die Charakterisierung verschiedener Insulin-Präparationen mithilfe der SEC-MALS-Technik gezeigt.

Abbildung 3 zeigt die Resultate für die Probe 1. Gegenüber der kleineren Fraktion, die aus Hexamer besteht, wird der Hauptanteil aus Monomer gebildet, das davon sehr gut abgetrennt wurde. Obgleich beim UV-Signal nicht über den gesamten Molmassenbereich Peaks sichtbar sind, beweist doch das LS-Signal, dass sich die gemessenen Molmassen über den kompletten Bereich zwischen Mono- und Hexamer verteilen. Dabei ist erwähnenswert, dass mithilfe des Lichtstreusignals das Hexamer tadellos detektierbar war, während das UV-Signal nur eine sehr kleine Menge dieser Fraktion andeutet. Dieser Umstand zeigt die außerordentlich hohe Empfindlichkeit der LS gegenüber großen Molekülen. Der Vergleich der Proben 1 und 2 zeigt, dass die Zugabe von 0,1 mM Zink das Gleichgewicht zwischen den Spezies deutlich von der Monomerseite (Probe 1) hin zur Hexamerseite (Probe 2) verschiebt. Im Gegensatz zur UV-Messung ist aus den Lichtstreudaten klar zu schließen, dass im kleineren Peak der Probe 2 ein ungefähres Gleichgewicht zwischen Monomer und Dimer existiert, während der große Peak das Hexamer repräsentiert. Zwischen diesen beiden Peaks werden keine Molmassen angezeigt.

Erhöht man die Zugabe von Zink, so kommt es zu einer vollständigen Verschiebung der Molekülspezies hin zum Hexamer (s. Abb. 5). Außerdem wird mit der Molmasse von 70 kDa eine neue Erscheinungsform des Insulins detektiert, die als Dodecamer identifiziert wurde. Obwohl es nur in geringer Menge vorhanden ist, lässt es sich in der LS-Messung einwandfrei darstellen. Somit ist SEC-MALS sehr gut geeignet, um das Selbst-Assoziierungsverhalten von Proteinen zu untersuchen. Im Folgenden werden Daten zur Injektion unterschiedlicher Probenmengen (50 und 200 µL) der gleichen Probe gezeigt. Wird das injizierte Volumen erhöht, so wirkt sich dies deutlich auf das Gleichgewicht der Molekülspezies aus (s. Abb. 6, laborpraxis.de). Bei höherer Insulinmenge verschiebt es sich zugunsten des Dimers. Werden 50 µL gegeben, findet man als kleinste Form das Monomer, während es bei 200 µL Injektionsmenge das Dimer ist. Der Anteil an Hexamer ist in beiden Ansätzen gleichbleibend und zeigt keine Tendenz, größere Oligomere zu bilden. Bei Probe 3 ist praktisch kein Effekt bei veränderter Injektionsmenge (50 µL bzw. 200 µL) zu sehen (s. Abb. 7, laborpraxis.de). Durch den Zinkanteil von 0,3 mM wird das System offenbar im Hexamer-Zustand gehalten, sodass in beiden Ansätzen die gleichen Molmassen zu finden sind. Es wird deutlich, dass sich das Hexamer bezüglich der Selbst-Assoziation völlig anders verhält als das Monomer.

Bedeutung der Mehrwinkellichtstreuung wächst

MALS erweist sich als die Methode der Wahl, wenn es darum geht, Assoziationsphänomene sowohl bei großen Proteinen und Antikörpern als auch bei Peptiden mit niedrigeren Molmassen zu untersuchen. Da die Anwendung von Proteinen und Peptiden im therapeutischen Bereich stetig wächst, wird auch die Nutzung von MALS als leistungsfähige analytische Technologie deutlich an Bedeutung gewinnen.

* P.-O. Wahlund: Novo Nordisk A/S, 2760 Måløv, Dänemark

* *D. Roessner: Wyatt Technology Europe GmbH, 56307 Dernbach

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