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SPECIAL PROBENVORBEREITUNG

Quantitative Wasserbestimmungmit NIR-Laser

| Autor/ Redakteur: MARKUS ORTLIEB* / Marc Platthaus

Wie viel Wasser ist in einer einzigen Zelle? – So einfach diese Frage klingt, so schwierig ist deren Beantwortung. An der Ruhr-Universität Bochum steht eine neuartige, labelfreie Methode zur Verfügung, die erstmals quantitative Aussagen über den Wassergehalt lebender Zellen erlaubt.

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Schematischer Aufbau eines NIR-Lasers.
Schematischer Aufbau eines NIR-Lasers.
( Archiv: Vogel Business Media )

Wie viel Wasser ist in einer einzigen Zelle? – So einfach diese Frage klingt, so schwierig ist deren Beantwortung. An der Ruhr-Universität Bochum steht eine neuartige, labelfreie Methode zur Verfügung, die erstmals quantitative Aussagen über den Wassergehalt lebender Zellen erlaubt. Sie ist derart leistungsfähig, dass eine Bestimmung sogar auf Einzelzellniveau möglich ist. Auch Veränderungen aufgrund des Einflusses diverser Wirkstoffe auf die Zelle können quasi in Echtzeit beobachtet werden. Das neu entwickelte Nahinfrarotlasermikroskop vereint die Möglichkeiten und Vorzüge eines Mikroskops mit denen eines Nahinfrarotlasers. Sie kommt damit ohne umfangreiche Probenpräparation aus.

Für die klinische Medizin ist der Wassergehalt von großer Bedeutung, da er als Regulator von Zellfunktionen dient. Schon geringe Mengen Pharmaka und biochemisch aktive Substanzen, wie zum Beispiel Insulin, beeinflussen den intrazellulären Wassergehalt. Diese Änderungen der intrazellulären Wassermenge, beziehungsweise des damit verbundenen Zellvolumens, sind Auslöser für verschiedenste Prozesse innerhalb einer Zelle, von der Regulation diverser Stoffwechselprozesse, bis hin zu Rezeptorrecycling, Hormonabgabe, Zellvermehrung und Zelltod.

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Diabetes inipidus oder Grauer Star sind zum Beispiel Krankheiten, die auf einer Fehlregulation des Wasserhaushaltes basieren. Bis heute fehlen der klinischen Medizin allerdings Techniken, die eine quantitative nicht invasive Abschätzung des intrazellulären Wasservolumens im lebenden Gewebe erlauben.

Was leisten die bisher eingesetzten Methoden?

Keine Methode ist in der Lage, alle offenen Fragen der Wissenschaft gleichermaßen gut zu beantworten. Jede hat Stärken, aber auch Schwächen. Betrachtet man jedoch eine ausgewählte Fragestellung, so zeigt sich, dass eine bestimmte Methode geeigneter sein kann als alle anderen.

Die diffusionsgewichtete 1H-NMR, die vereinfacht in der Lage ist, die Nettoverschiebung von Molekülen zu messen, hat sich z.B. zu einer Standardmethode in der medizinischen Diagnostik von Hirninfarkten entwickelt. Während eines Hirninfarktes kommt es zu einer Unterbrechung oder einer starken Verringerung der Durchblutung bestimmter Gehirnareale. Das geschädigte Gewebe hebt sich aufgrund veränderter Diffusionseigenschaften vom gesunden Gewebe ab. Dieser Effekt kann mit der Kernspinresonanz schon wenige Minuten nach Erleiden des Infarktes beobachtet werden. Quantitative Aussagen über den Wassergehalt auf Einzelzellniveau sind aber mit dieser Methode nicht möglich.

Die Fluoreszenz-Mikroskopie ist in der zell- und molekularbiologischen Forschung bis jetzt die Methode, um intrazelluläre Strukturen und deren Dynamik detailliert sichtbar zu machen. Wie der Name vermuten lässt, müssen allerdings für diese Methode Zellbestandteile fluoreszierend, also „selbstleuchtend“, sein. Besitzt die Zelle von sich aus keine fluoreszierenden Bestandteile, versucht man mit diversen Techniken künstlich Fluoreszenzmarker in die Zelle einzubringen, um ausgewählte Komponenten der Zelle selektiv zu markieren. Die Wissenschaftler konnten in den letzten Jahren aus einem stetig wachsenden Pool unterschiedlichster Markermoleküle schöpfen.

Trotz des großen Erfolgs der Fluoreszenz-Mikroskopie verhindern wesentliche Nachteile den uneingeschränkten Einsatz: Ist es für ein Experiment erforderlich, ausgesuchte Bereiche einer Zelle anzufärben, muss im Vorfeld eine aufwändige Präparation der Probe erfolgen. Oft beeinflussen die angebundenen Farbstoffe auch die untersuchte Probe. Bestenfalls kommt es dann nur zu einer Störung der physiologischen Funktionen der Zelle. Häufig verlieren allerdings kleine Moleküle ihre Funktionsfähigkeit durch den Fluoreszenznachweis vollständig.

Es ist ein weiterer Nachteil dieser Methode, dass die verwendeten Farbstoffe photochemischen Reaktionen unterliegen. Als Folge dieser Reaktionen bleichen sie aus; sie verlieren sozusagen an Leuchtkraft. Langzeitbeobachtungen, mit der Fluoreszenzstärke als Indikator für zelluläre Prozesse, sind deshalb auf eine maximale (effektive) Beobachtungszeit beschränkt. Aus diesen Gründen ist eine mikroskopische Technik wünschenswert, die spezifisch ist, aber keine Markierung der Proben erfordert, also labelfrei ist. Mögliche Methoden sind die Raman-Mikroskopie und die Infrarot-Mikroskopie.

Raman-Mikroskopie: Hohe Energiedichte schädigt Zellen

Bei dieser Art der Mikroskopie wird die zu untersuchende Probe über einen Laserpuls angeregt und die resultierende Raman-Streuung detektiert. Diese Technik bietet eine sehr hohe Auflösung. Wegen der geringen Effizienz des Streuprozesses sind Laserleistungen größer 10 mW nötig, um vertretbare Messbedingungen realisieren zu können. Diese enorme Energiedichte kann allerdings Zellen schädigen und so eine Untersuchung zellulärer Vorgänge erschweren. Es gibt Lösungsansätze zur Verstärkung des Streusignals (z.B. SERS, Surface Enhanced Raman Scattering). Diese Ansätze lösen das Problem der hohen Energiedichte. Da sie jedoch die Zelle anderweitig schädigen, wird das Problem durch diese Methoden nur verlagert.

Auch die technische Weiterentwicklung der oben erwähnten Raman-Mikroskopie, wie z.B. CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) liefert keine brauchbaren Verbesserungen. Diese Methode benötigt zwar nur wenige 100 µW Laserleistung und lässt in-vivo-Studien von Zellen zu; auch Aussagen über den relativen Wassergehalt sind möglich. Eine exakte Quantifizierung der Wassermoleküle ist dagegen nicht möglich. Umfangreich und kostspielig ist zudem der apparative Aufwand durch die Verwendung von zwei Laserquellen.

Konventionelle Mikroskopie und Infrarotspektroskopie

Die Alternative ist die Infrarot-Mikroskopie. Aus der Infrarot-Spektroskopie ist bekannt, dass organische Moleküle spezifische Absorptionsbanden im infraroten Bereich des elektromagnetischen Spektrums besitzen - ähnlich einem Fingerabdruck. In den vorliegenden Messungen machte man sich die Stärke dieses Fingerabdruckes zu Nutze. Je stärker der Fingerabdruck bzw. das gemessene Absorptionssignal ist, desto höher ist die Wasserkonzentration in der Probe.

Die Bilderfassung erfolgt durch eine Abrasterung des Fokuspunktes über die Probe (Vgl. Abb.1). Die Probe wird zu diesem Zweck durch xy-Verschiebetische zeilenweise verschoben, wobei am Ende jeder Zeile die Verschiebung in die nächste Zeile erfolgt. Die Datenaufnahme und die Steuerung der Verschiebeeinheiten erfolgt mit einem eigens erstellten, auf LabView basierenden Programm. Im Gegensatz zur Fluoreszenz-Methode oder einiger Raman-Mikroskopiemethoden müssen die Proben keine aufwändige Präparation durchlaufen. Auch die mit der Zeit fortschreitende Signalabnahme, die in der Fluoreszenz-Mikroskopie durch das Photobleichen der Farbstoffe auftritt, tritt nicht auf, wodurch prinzipiell eine beliebig lange Beobachtungszeit möglich ist. Der entscheidende Vorteil gegenüber der Raman-Mikroskopie ist die exakte Quantifizierung der Probenmoleküle. Aufgrund der höheren Photonenausbeute, kann unsere Methode zudem durch ihre Schnelligkeit überzeugen.

Der verwendete durchstimmbare Laser emittiert nahinfrarote Strahlung im Wellenlängenbereich von 1530-1570 nm. Da dieser Wellenlängenbereich auch in der Telekommunikationsbranche Anwendung findet, sind sowohl der Laser als auch andere Komponenten preiswert verfügbar.

Einsatzmöglichkeiten der Nahinfrarotmikroskopie

In einer Auftragsarbeit für ein Unternehmen aus der Lebensmittelbranche, das mehr über die Haltbarkeit seiner Produkte wissen wollte, wurden von der Arbeitsgruppe Feldsalatblätter per Infrarot-Mikroskopie näher analysiert. Im Experiment konnte gezeigt werden, dass ein einzelnes Salatblatt schneller vertrocknet, als ein Salatblatt mit Wurzel (Abb. 3).

Untersuchungen auf Einzelzellniveau sind mühelos durchzuführen. Es ist möglich, in dynamischen Prozessen die Wasserkonzentration quasi in Echtzeit zu bestimmen. Man kann der Zelle Wirkstoffe zuführen und sofort unter dem Mikroskop feststellen, welche Auswirkungen die Applikation hat. Nahinfrarot-Mikroskopie ist in der Lage, quantitative und qualitative Aussagen über den Wasserhaushalt lebender Zellen zu treffen (Abb. 4).

Was ist für die Zukunft noch zu erwarten?

Das Potenzial ist bei weitem noch nicht ausgeschöpft. Durch Verwendung eines konfokalen Strahlenganges - eine in der Mikroskopie bereits etablierte Technik - sollte es möglich sein, sogar ein dreidimensionales Abbild des Wassergehalts der Zelle zu erstellen.

Durch den Einbau eines Spiegel-Galvanometerscanners kann darüber hinaus die Geschwindigkeit der Bildaufnahme weiter gesteigert werden, so dass die Beobachtung schneller Austauschprozesse möglich wäre. Mit Verwendung dieser Scanner muss die Probe im Gegensatz zum bisherigen Aufbau nicht mehr bewegt werden. Der Laserstrahl scannt über einen beweglichen Spiegel die Probe ab.

Seit kurzer Zeit sind InGaAs-Kameras kommerziell erhältlich. Diese Kameras besitzen eine für unsere Bedürfnisse ausreichend hohe Empfindlichkeit. Die Notwendigkeit des Scannens entfällt mit diesen Kameras vollständig; zudem ermöglichen sie Bildaufnahmeraten von bis zu 50 Bildern pro Sekunde. Da die bisherigen Experimente zeigen, dass das Einströmen von Wasser in die Zelle in wenigen Millisekunden vonstatten geht, könnten wir mit diesen Kameras diesen Effekt genau verfolgen.

Die hohe zeitliche Auflösung, verbunden mit der hohen Empfindlichkeit, wird es ermöglichen, physiologische Veränderungen aufgrund von Veränderungen im Wasserhaushalt einzelner Zellen zu beobachten. Dies stellt die Entwicklung neuer therapeutischer Methoden in Aussicht. Noch steht man mit der Forschung am Anfang, aber für die Medizin und für die Pharmaforschung könnten die Infrarot-Verfahren ganz neue Wege eröffnen.

* Ruhr-Universität Bochum, Lehrstuhl für Physikalische Chemie II, 44780 Bochum

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