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WASSER- UND UMWELTANALYTIK Schadstoffe - Bewährte Konzepte in der Gaschromatographie

Autor / Redakteur: BURKHARD SCHMIDT*, ZHEN XU*, ALEXANDER RUß* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Hohe Empfindlichkeit und hohes Trennvermögen machen die Kapillar- Gaschromatographie noch immer zu einem unverzichtbaren, leistungsstarken analytischen Werkzeug – speziell in der Rückstandsanalytik.

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Hohe Empfindlichkeit und hohes Trennvermögen machen die Kapillar- Gaschromatographie noch immer zu einem unverzichtbaren, leistungsstarken analytischen Werkzeug – speziell in der Rückstandsanalytik. Zwei Beispiele, das Herbizid Glufosinat und das IsomerengemischNonylphenol sollen das breite Anwendungsspektrum der Methodik in Verbindung mit der Massenspektroskopie aufzeigen.

Alle Organismen, so auch der Mensch, sind gewollt oder ungewollt einer Vielzahl organischer Verbindungen ausgesetzt, die anthropogenen (z.B. Schadstoffe, Pestizide, Pharmaka) oder natürlichen Ursprungs (z.B. Mycotoxine, Allelochemikalien) sind. Einige Substanzen zeigen bereits in geringen Konzentrationen negative oder positive biologische Effekte. Der Nachweis dieser Verbindungen, die lipophile bis hydrophile Eigenschaften haben, ist seit Jahrzehnten Herausforderung für die analytische Chemie - besonders im Falle hochtoxischer Schadstoffe. Ein erster Schritt war die Entwicklung der Gaschromatographie (GC).

Es kam dann z.B. zur Entwicklung der Kapillar-GC, zur Kopplung von GC und Massenspektroskopie (GC-MS) und zur Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC). In jüngster Zeit ist die HPLC-MS zu nennen, mit der organische Substanzen mit hoher Empfindlichkeit analysiert werden können. Neuere Rückstandsmethoden für Pestizide basieren schon auf der HPLC-MS. Trotzdem untersucht man z.B. Wasser- oder Bodenproben oft mittels GC gekoppelt mit verschiedenen Detektoren (FID, ECD, MSD). Gründe sind die hohe Trennleistung und Empfindlichkeit, die auch durch eine selektive Detektion (ECD, MSD) von Substanzen/Substanzgruppen erreicht wird. Eine ähnlich leistungsstarke Analytik ist mit konventioneller HPLC nicht möglich.

Aus Sicht eines Hochschulchemikers, der mit unterschiedlichsten analytischen Problemen konfrontiert ist, wird auch in Zukunft die GC eine wesentliche Rolle bei der Analyse von Stoffen in Umweltproben spielen. HPLC-MS-Anlagen sind wünschenswert, überschreiten allerdings hinsichtlich Kosten und Betreuung die Möglichkeiten vieler Hochschulinstitute. Diese Situation soll Anlass sein, mit zwei Beispielen an bewährte Konzepte der GC-Analyse zu erinnern.

Der erste Schritt - Derivatisierung für die GC

Die Anwesenheit polarer Gruppen (COOH, OH, R2C=O, SH, NH2) in Molekülen führt dazu, dass die zu analysierenden Verbindungen eine hohe Polarität und Tendenz zur Bildung von Wasserstoffbrücken aufweisen. Beide Faktoren verursachen eine geringe Flüchtigkeit sowie andere Phänomene (z.B. Adsorption, thermische/chemische Instabilität), die eine Analyse der Substanzen mittels GC erschweren oder unmöglich machen. Durch geeignete Derivatisierung lassen sich Verbindungen mit polaren Gruppen in unpolarere Derivate umwandeln; diese sind dann bedingt durch eine höhere Flüchtigkeit und geringere Adsorptionstendenz für die GC zugänglich.

Derivatisierungsreaktionen für die GC sollten bei geringen Konzentrationen der zu analysierenden Substanzen rasch, quantitativ und reproduzierbar ablaufen. In der Regel verwendet man reaktive Derivatisierungsreagenzien, die entweder nur mit bestimmten funktionellen Gruppen (z.B. Acetylierung von Alkoholen/Phenolen mit Essigsäureanhydrid, Methylierung von Carbonsäuren mit Diazomethan) oder mit einer Reihe von Gruppen zu Derivaten reagieren (z.B. Silylierung von Carbonsäuren, Alkoholen, Phenolen)

Derivatisierung und GC-Analytik des Herbizids Glufosinat

Beim Totalherbizid Glufosinat (DL-Phosphinothricin) handelt es sich um eine Aminosäure (s. Abb. 1). Die chirale Verbindung wird als Racemat (z.B. als Basta) eingesetzt, wobei nur das L-Enantiomer herbizide Aktivität besitzt. Glufosinat weist günstige ökotoxikologische und ökochemische Eigenschaften auf. Unter anderem aus diesem Grund wurden verschiedene Glufosinat-resistente Pflanzen (z.B. Zuckerrübe) auf gentechnologischem Wege hergestellt, was einen selektiven Einsatz von Glufosinat in der Landwirtschaft ermöglicht.

Bei Glufosinat zählt zur Rückstandsdefinition neben der Ausgangsverbindung der Metabolit MPP (3-Methylphosphinicopropionsäure; Abb. 1). Sowohl Glufosinat als auch MPP sind direkt nicht mit GC analysierbar. Zur Rückstandsmethode (DFG) gehört daher eine Derivatisierung von Glufosinat und MPP mit Orthoessigsäuretrimethylester, bei der die Säurefunktionen (COOH, POH) und Aminfunktion zu Methylestern bzw. zum Acetamid umgewandelt werden (Abb. 1). Bei der Analyse von Bodenproben wird mit Wasser extrahiert. Nach Zentrifugieren und Entfernen des Wassers wird der verbleibende Rückstand in Essigsäuremethylester suspendiert, mit Orthoessigsäuretrimethylester versetzt und vier Stunden unter Rückfluss erhitzt. Nach Einengen der Lösung erfolgt die GC-Analyse.

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Nach der Rückstandsmethode soll die GC-Analyse von Glufosinat und MPP mit einem Flammenphotometer-Detektor (FPD) nach Auftrennung an einer Säule belegt mit Carbowax 20 M (FD: 0,25 µm; L: 10 m; ID: 0,53 mm) erfolgen. Ein FPD stand nicht zur Verfügung, so dass alternativ ein massenselektiver Detektor (MSD) eingesetzt wurde. Im GC wurde als Trennsäule eine HP-Innowax (Crosslinked Polyethylene Glycol; L: 15 m, ID: 0,25 mm, FD: 0,25 µm) nach einer Vorsäule (L: 5 m; ID: 0,32 mm) verwendet. Zur Erreichung ausreichend hoher Empfindlichkeit erfolgte die Analyse im Selected Ion Mode (SIM). Als charakteristische Fragment-Ionen des Glufosinat-Derivats wurden m/z 192 und 150 gewählt, die im MS mit 51 bzw. 84 Prozent Häufigkeit auftauchen; die Fragment-Ionen beim MPP-Derivat waren m/z 165 (74 Prozent) und 149 (27 Prozent). Eichgeraden für das Glufosinat- und MPP-Derivat zeigt Abb. 2. Das Detektionslimit beider Derivate lag unter 0,075 µg/ml Äquivalenten freier Säure Glufosinat (entsprechend den Anforderungen der Rückstandsmethode).

Mit der Methode wurde der Abbau von Glufosinat im Boden einer bewachsenen Fläche studiert. Die Aufwandmenge des Herbizids (als Produkt: Basta) liegt bei ?1,5 kg/ha. Für die Studien wurden je drei Parzellen mit zwei- bzw. vierfacher Aufwandmenge behandelt. Diese wurden vier Stunden nach Applikation künstlich beregnet (10 mm); nach fünf Stunden (Tag 0) wurden die ersten Proben gezogen. Abb. 3 zeigt die Analysendaten für die obere Bodenschicht (0-10 cm). In vier Tagen ging sowohl bei vier- als auch zweifacher Aufwandmenge die Konzentration an Glufosinat auf 10-20 Prozent des anfänglichen Wertes zurück. MPP zeigte Maxima nach ein bis zwei Tagen und fiel dann auch ab.

Isomere und Kongenere in der Rückstandsanalytik

Pestizide, Pharmaka oder deren Metaboliten, die in Umweltproben analysiert werden, sind definierte Einzelverbindungen. Über diese hinaus interessieren in der Rückstandsanalytik seit ihren Anfängen Gemische, die aus chemisch äußerst ähnlichen Substanzen bestehen. Ein bekanntes Beispiel sind die polychlorierten Biphenyle (PCB), die viele Jahre in zahlreichen Anwendungen eingesetzt wurden, deren Verwendung jedoch seit Beginn der 1970er Jahre zunehmend eingeschränkt wurde; heute ist der Einsatz der PCB verboten. Die PCB leiten sich vom Grundgerüst Biphenyl ab und bestehen - je nach industriellem Produkt - aus bis zu 209 Kongeneren, die sich in der Anzahl und Position der Chlorsubstituenten unterscheiden.

Die polychlorierten Dibenzo-p-dioxine (PCDD) und Dibenzofurane (PCDF), die unbeabsichtigt in verschiedenen industriellen und natürlichen Prozessen entstehen können, sind ein weiteres Beispiel. Man unterscheidet hier 75 bzw. 135 Kongenere. Die Auftrennung der PCB, PCDD sowie PCDF ist nur mittels GC möglich. Sie ist notwendig, da sich z.B. die PCDD in ihrer Toxizität außerordentlich stark unterscheiden. Die Identifizierung der einzelnen Kongenere in den Chromatogrammen gelang bei den PCB, PCDD und PCDF nur durch gezielte Synthese der Einzelverbindungen.

GC-EIMS-Analytik der Isomeren von Nonylphenol

Ein aktuelles Beispiel für ein Gemisch, das nur schwer bis zu den einzelnen Komponenten analysiert werden kann, ist Nonylphenol. Technisch wird Nonylphenol (NP) aus Nonen, d.h. trimerisiertem Propen, und Phenol hergestellt. Neben kleineren Mengen an ortho- sowie dialkyliertem Phenol entstehen als Hauptprodukte etwa 20 para-NP-Isomere, die sich in der Verzweigung der Nonyl-Seitenkette unterscheiden und sehr ähnliche physikochemische Eigenschaften haben. In den meisten Anwendungen wird das NP-Gemisch als Polyethoxylat (z.B. Tensid) eingesetzt, welches in der Umwelt rasch zum NP abgebaut wird. Die para-NP-Isomere selbst sind - vermutlich in Abhängigkeit von ihrer chemischen Struktur - endokrin wirksam und schwer abbaubar, so dass die detaillierte Analytik mittels GC erforderlich ist. In der routinemäßigen GC-Analytik ist das Gemisch nicht vollständig auftrennbar; die genaue Zusammensetzung war deshalb bisher unbekannt.

An einer Säule mit 100 m Länge (ID: 0,25 mm; FD: 0,25µm) belegt mit Dimethylpolysiloxan (100 Prozent) kann das Gemisch jedoch weitgehend auftrennt werden, wobei mit verschiedenen Temperaturprogrammen (Endtemperatur: 170, 180 bzw. 190 °C) 20 Isomere nachgewiesen werden können. Diese lassen sich mit EIMS gemäß der Verzweigung der Kette an den beiden zum Phenyl-Ring benachbarten Kohlenstoffatomen (a, b) in verschiedene Gruppen einteilen. Alle para NP-Isomere weisen im MS verschiedene charakteristische Fragment-Ionen auf Grund des Zerfalls der Seitenkette ausgehend vom Molekül-Ion bei m/z 220 auf. Ferner zeigen alle NP-Isomere Fragment-Ionen mit schwacher Intensität bei m/z 107, 91, 77, 65 und 55, die vom Zerfall des Aromaten verursacht werden.

Mindestens 15 Peaks im technischen NP-Gemisch rühren von Isomeren mit quartärem a-Kohlenstoff her; diese Isomere bestehen aus drei Gruppen. Bei neun handelt es sich um a,a-dimethyl-a-hexyl-verzweigte Isomere, die durch den Verlust des Hexylradikals im MS praktisch nur m/z 135 aufweisen; die verschiedenen Isomere dieser Gruppe unterscheiden sich im MS kaum. Weitere vier sind a-methyl-a-ethyl-a-pentyl-verzweigte Isomere, die durch Abspaltung des Ethyl- (m/z 191), Pentyl- (m/z 149), des Ethyl- und Pentylradikals (m/z 121) sowie der drei Alkylradikale (intensiv m/z 107) jeweils charakteristische Massenspektren ergeben. Zwei der Isomere sind a-methyl-a-propyl-a-butyl-verzweigte Verbindungen, die spezifische Fragment-Ionen bei m/z 177 (- Propyl), m/z 163 (- Butyl), m/z 121 (- Propyl, - Butyl), m/z 107 (- Methyl, - Propyl, - Butyl) liefern (Abb. 4).

Neben diesen erscheinen im Gaschromatogramm weitere Peaks. Die zugehörigen MS im Bereich der Fragmentierung der Seitenkette lassen auf NP-Isomere mit zwei benachbarten tertiären Kohlenstoff-Atomen schließen.

Zur Bestätigung der MS-Fragmentierung der Seitenketten-verzweigten NP wurden einzelne Isomere mit a,a-Dimethyl-a-hexyl- und a-Methyl-a-ethyl-a-pentyl-Gruppe via Friedel-Crafts-Alkylierung aus entsprechenden Nonanolen synthetisiert und über Kieselgel gereinigt. Nicht kommerziell verfügbare Nonanole wurden dabei durch Grignard-Reaktion oder über Lithium-Organyle dargestellt (Reinigung: Destillation). Die Strukturen der synthetisierten NP-Isomere wurden mit NMR- und Massen-Spektroskopie bewiesen. Mit Hilfe der synthetisierten NP-Isomere konnten dann die im technischen Produkt identifizierten Isomere durch Vergleich der Retentionszeiten und durch Aufdotieren bestätigt sowie ihre Massenanteile quantifiziert werden (Abb. 5).

* Institut für Biologie V, LehrstuhlÖkologie/Ökotoxikologie/Ökochemie, RWTHAachen, Worringerweg 1, 52056 Aachen

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