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Enantiomere sicher unterscheiden

Schnelle Methodenentwicklung zur Trennung chiraler Substanzen

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Besonders für die Forschung und Entwicklung von Wirkstoffen ist eine schnelle Methodenentwicklung notwendig, da bei neu entwickelten Pharmazeutika nicht auf bereits etablierte Methoden zurückgegriffen werden kann und die Wahl der richtigen chromatographischen Säule und analytischen Bedingungen für eine geeignete Trennung neu optimiert werden muss.

Method Scouting für pharmazeutische Wirkstoffe

Für die Analyse von fünf unbekannten pharmazeutischen Wirkstoffen (API, ac­tive pharmaceutical ingredient) wurde ein Shimadzu-Nexera-UC-Chiral-Screening-System verwendet. Neben einer CO2-Pumpe und einer quarternären Modifierpumpe bestand das System aus einem Autosampler mit Loop-Injektion, einem Säulenofen mit Säulenschaltventil zur Ansteuerung von sechs verschiedenen Säulen und einem Rückdruckregulator. Die Detektion erfolgt mit einer Kombination aus einem Photodiodenarray-Detektor und einem LCMS-8040-Triple-Quad-Massenspektrometer. Die Steuerung der Anlage sowie die Datenauswertung erfolgten mithilfe der Labsolutions-Software, Version 5.82. Die Erstellung der Methode und der Sequenz erfolgte mit dem speziellen Software-Add-On Method Scouting Solutions (s. Abb. 4, online). Für die konkrete Methodenentwicklung über Nacht wurde eine Sequenz von Gradientenläufen mit einer Dauer von 6 min bei einer Temperatur von 40 °C bei einem Rückdruck von 150 bar und einer Flussrate von 2 ml/min erstellt.

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Die Trennung erfolgte auf den folgenden Säulen der Firma Phenomenex mit den Abmessungen 250 x 4,6 mm und einer Partikelgröße von 5 µm: Lux Amylose-1, Lux-Amylose-2, Lux Cellulose-1, Lux Cellulose-2, Lux Cellulose-3 und Lux Cellulose-4. Als Modifier wurden Methanol und Methanol mit einem Zusatz von 0,1 % Ameisensäure verwendet.

Für die Detektion wurde mittels Photodiodenarray-Detektion ein Spektrum über 190 bis 70 nm aufgezeichnet, um die massenspektrometrischen Signale zu verifizieren. Für die MS-Detektion wurde ESI-Ionisation im positiven Modus verwendet und dabei Einzelmassenspuren im Q1 aufgezeichnet. Das Nebulizing-Gas wurde auf 2 l/min eingestellt, das Drying-Gas auf 15 l/min. Die Desolvation Line wurde auf 250 °C geheizt, der Heizblock auf 400 °C.

Screening-System schafft Arbeitserleichterung

Betrachtet man die Ergebnisse des Screenings für einen der Wirkstoffe auf den sechs verschiedenen Phasen, wie in Abbildung 2 dargestellt, wird die bedeutende Arbeitserleichterung durch ein Screening-System sofort ersichtlich. Obwohl alle vier Cellulose-Phasen auf dem gleichen Material basieren, ist die Trennwirkung stark unterschiedlich. Wohingegen auf der Cellulose-2- und Cellulose-4-­Säule keinerlei Trennung der beiden Enantiomere erreicht werden konnte, sind sie bei einer Trennung auf Cellulose-1 und Cellulose-3 gut voneinander getrennt.

Diese ersten Ergebnisse des schnellen Screenings können, wenn nötig, anschließend verwendet werden, um die Analysenergebnisse zu optimieren. Dabei können im Idealfall durch weitere Anpassungen der Parameter, z.B. Gradientenprogramm bzw. Anteil an Modifier bei iso­kratischen Trennungen, Temperatur oder Rückdruck, die Trennleistung verbessert und die Analysendauer weiter reduziert werden. Die Ergebnisse der optimierten Trennungen für die fünf verwendeten pharmazeutischen Wirkstoffe sind in Abbildung 3 zusammengefasst. Für drei der fünf Wirkstoffe war eine Kombination der Cellulose-3-Säule mit 30 % Methanol mit Ameisensäurezusatz als Modifier am besten für die Trennung der Enantiomerenpaare geeignet, für die zwei anderen erwies sich die Cellulose-4-Säule und 30 % reines Methanol als effizient. Für alle Analyten konnte in der photometrischen wie auch in der massenspektrometrischen Detektion ohne Splitting eine Auflösung > 1,5 und eine relative Standardabweichung der Retentionszeit < 2,0 % erzielt werden.

Zuverlässige, robuste und einfache Alternative

Mit dem Nexera-UC-Chiral-Screening-System ist eine automatisierte, schnelle und einfache Methodenentwicklung für chirale pharmazeutische Verbindungen möglich. In einer Sequenz können dabei bis zu elf Säulen und vier verschiedene Modifier getestet werden, um auch bei schwer vorherzusagenden Retentions­mechanismen, wie sie in der chiralen Chromatographie häufig zu finden sind, sicher arbeiten zu können. Im präsentierten Beispiel wurde für fünf chirale pharmazeutische Wirkstoffe innerhalb von zwei Tagen eine schnelle und einfache isokratische SFC-PDA/MS-Methode durch das Screening von sechs Säulen und zwei Modifiern entwickelt und bezüglich analytischer Trennung und Sensitivität optimiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich die SFC-MS als zuverlässige, robuste und einfache Alternative zur Routine-HPLC-Analyse eignet.

* Dr. I. Möller: , Shimadzu Deutschland GmbH, 47269 Duisburg

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