HPLC / UHPLC So gelingt der sichere Methodentransfer von HPLC auf UHPLC und umgekehrt

Beim Austausch zwischen Forschung und Qualitätskontrolle ist es oft notwendig, die analytischen Methoden zwischen HPLC und UHPLC zu übertragen. Moderne HPLC-Anlagen und Softwaretools unterstützen die Anwender beim Methodentransfer auf andere Systeme.

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In der Pharma- und Lebensmittelindustrie sowie in verschiedenen anderen Branchen ist die High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) immer noch weit verbreitet bei der qualitativen und quantitativen Analyse von Zielverbindungen oder Verunreinigungen. In den letzten Jahren fand aus Gründen der Effizienz- und Durchsatzsteigerung auch die Ultra-High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC) Einzug in die Labore.

Der Unterschied zwischen diesen beiden Techniken liegt im maximalen Systemdruck. Durch die höhere Druckstabilität von UHPLC-Instrumenten führen sie Analysen bei ähnlicher Trennleistung in kürzerer Zeit durch. Anwendung finden diese High-End-Geräte vor allem in Forschung und Entwicklung, um neue analytische Methoden möglichst schnell gestalten zu können. Auch in der klinischen Analytik werden sie eingesetzt, um durch die schnellere Analysenzeit den Probendurchsatz und die Geräteauslastung zu erhöhen.

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In vielen Bereichen der Routineanalytik hingegen werden weiterhin normale HPLC-Systeme zur Qualitätskontrolle und -Sicherung verwendet, nicht zuletzt aufgrund ihrer überragenden Robustheit und niedrigeren Wartungskosten. In Laboren, die über beide Arten von Systemen verfügen, werden daher einerseits Methoden von der HPLC auf die UHPLC übertragen, um den Durchsatz zu erhöhen; andererseits werden Methoden, die in der Forschung auf UHPLC-Systemen entwickelt wurden, aus Gründen der Robustheit in der Routineanalytik von der UHPLC zurück auf die HPLC übertragen.

Der Transfer bestehender Methoden zwischen verschiedenen Systemen besteht jedoch nicht nur aus einer einfachen Verkürzung der Analysendauer. Auch Parameter, wie z.B. die Flussrate, das Zeitprogramm und nicht zuletzt die Abmessungen der verwendeten chromatographischen Säule, müssen bei einem Transfer zwischen HPLC und UHPLC modifiziert werden. Ähnliches gilt übrigens auch beim Transfer zwischen Systemen von einem Hersteller auf einen anderen. Ist der Methodentransfer nicht erfolgreich, kann es zu Unterschieden in der Elutionsreihenfolge, der Auflösung und den relativen Retentionszeiten kommen – kurz: die Analysenergebnisse sind nicht miteinander vergleichbar (s. Abb. 1). Welche Parameter sind also zu betrachten?

Parameter für den Methodentransfer – Säulenabmessungen und analytische Bedingungen

Wechselt man von der HPLC zur UHPLC, ist die offensichtlichste Veränderung die Wahl einer UHPLC-geeigneten Säule. Diese Säulen sind kürzer, haben einen schmaleren inneren Durchmesser und eine kleinere Partikelgröße. Doch damit nicht genug: Sind die Säulenabmessungen angepasst, folgen die analytischen Trennbedingungen. Die für die HPLC-Methode optimierten Parameter sind nur begrenzt für die UHPLC-Methode geeignet, ebenso sind die besten Parameter für eine UHPLC-Methode nicht optimal für eine HPLC-Analyse.

Beim Transfer bestehender Methoden zwischen den beiden Systemen sind vor allem folgende Parameter zu beachten:

• Flussrate,

• Zeitprogramm (des Gradienten, Ventil- und Eventschaltung o.ä.),

• Totvolumen des Systems,

• Datenaufnahmerate der Detektoren,

• Injektionsvolumen sowie

• Maximaldruck des Systems.

Eine Anpassung des Zeitprogramms ist vor allem bei der Gradientenanalyse unbedingt notwendig. Verkürzt man die Analysendauer ohne das Zeitprogramm des Gradienten anzupassen, verändert sich die Trennung maßgeblich. Im regulierten Umfeld sind zusätzlich relative Retentionszeiten und Elutionsreihenfolgen oftmals vorgeschrieben, daher muss das Zeitprogramm für einen erfolgreichen Methodentransfer auch hier zwingend angepasst werden.

Der manuelle Transfer von Methoden inklusive der Anpassung aller relevanten Parameter kann daher schnell komplex und zeitaufwendig werden. Um diese Schwierigkeiten zu vermeiden, bieten einige Hersteller von Flüssig-Chromatographie-Systemen Programme zur Umrechnung der nötigen Parameter für einen erfolgreichen Methodentransfer und sogar dezidierte (U)HPLC-Systeme speziell für den Methodentransfer.

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