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Feldflussfraktionierung

Trennung pharmazeutischer Verbindungen mit Feldflussfraktionierung

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Weiterentwicklung Hohlfaser-Fluss-FFF

Der Einsatzbereich der HF5 ist ähnlich breit gefächert wie bereits für andere Feldfluss-Fraktionierungstechniken berichtet. Ein besonderer Vorteil der Hohlfaser-Technologie sind dabei die geringe Probenverdünnung und die damit verbundene hohe Nachweisempfindlichkeit. Bisherige Ergebnisse lassen erkennen, dass die HF5 das Potenzial hat, sowohl in der pharmazeutischen Industrie als auch in der Proteomics-Forschung zu einem wichtigen Werkzeug zu werden. Zudem ist das Polymer, aus dem die Hohlfasern hergestellt werden, relativ preiswert, sodass kostengünstige HF5-Kartuschen als Einmalartikel verfügbar sind.

Aufgrund der unterschiedlichen analytischen Anforderungen im pharmazeutischen Bereich ist es sinnvoll, die HF5 als zusätzliche Methode zur Verfügung zu haben, ohne auf die Flachkanal-Fluss-FFF (AF4) verzichten zu müssen. Daher war die Entwicklung eines Systems für die Feldfluss-Fraktionierung notwendig, das sowohl mit AF4- als auch mit HF5-Trennkanälen betrieben werden kann. Die gesamte Flusssteuerung für Kanal und Kartusche erfolgt dabei durch das Eclipse Dualtec-Instrument (Wyatt Technology Europe).

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Das instrumentelle Set-Up (s. Abb. 2) gestaltete sich wie folgt:

  • Steuerung für AF4 und HF5: Eclipse Dualtec (Wyatt Technology Europe, Dernbach);
  • Detektion: 18-Winkel Lichtstreudetektor (MALS-Detektor) Dawn Heleos II; Differenzial-Refraktometer Optilab rEX (Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, USA);
  • HPLC: Degasser Agilent 1100, isokratische Pumpe Agilent 1100, Auto Sampler Agilent 1200, Agilent 1100 (VWD) Detektor (Agilent Technologies, Santa Clara, USA).

Hohe Nachweisempfindlichkeit durch weiterenentwickelte Feldflussfraktionierung

Eine wichtige Eigenschaft der Hohlfaser-Technik ist die geringere Probenverdünnung im Vergleich zur AF4. Dadurch wird eine höhere Nachweisempfindlichkeit ermöglicht (s. Abb. 3). Gezeigt ist die Höhe des UV-Signals als Funktion der Aufgabemenge des Enzymproteins Carboanhydrase (CAH) im Vergleich zwischen HF5 und zwei verschiedenen AF4-Kanälen, (SC: short channel und LC: long channel). Die Kanalhöhe ist vergleichbar (HF5 Radius 400 µm, Kanalhöhe der AF4 Kanäle 350 µm). Aufgrund des geringen Kanalvolumens von 100 µL sind die Peaks nach der HF5-Trennung um den Faktor 4 bzw. 6 höher.

In Abbildung 4 ist die HF5-Trennung eines Proteingemischs dargestellt. Es handelt sich um die Bestandteile: 1 - Carboanhydrase (1mer), 2 - BSA (1mer) + Carboanhydrase (2mer), 3 - Carboanhydrase (3mer), 4 - BSA (2mer), 5 - Apoferritin (1mer), 6 - Thyroglobulin (1mer) + Apoferritin (2mer), 7 - Apoferritin (3mer) + Thyroglobulin (2mer).

Das Fraktogramm aus der Trennung eines Proteingemischs in Abbildung 4 macht deutlich, dass die hier enthaltenen Komponenten – sowohl Monomere als auch Oligomere – problemlos nachweisbar sind. Es wird nahezu Basislinientrennung erreicht. Die Detektion von Dimeren und Oligomeren, wie sie hier exemplarisch gezeigt wird, ist beispielsweise in der Qualitätskontrolle von therapeutischen Antikörpern eine zentrale analytische Herausforderung. Der Anteil an solchen Agglomeraten darf nämlich einen bestimmten Prozentsatz nicht überschreiten. Andernfalls ist das Präparat für die therapeutische Anwendung nicht geeignet. Im folgenden Beispiel soll hierauf näher eingegangen werden.

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