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CHROMATOGRAPHIE Hochauflösende Aminosäurenanalyse durch Kapillar-HPLC

| Autor / Redakteur: J.Naidanow*, L.Minárikova**. Günes Barka***, Peter Földi**** / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

In den vergangenen Jahren haben sich für die Analyse von Aminosäuren die Methoden der Vordersäulen-derivatisierung mit anschließender Auftrennungen derselben durch Reversed-Phase-Chromatographie immer mehr gegenüber der klassischen Methode durchgesetzt. Dieser Beitrag beleuchtet die einzelnen Techniken und beschreibt dann die Vordersäulen-derivatisierung der Aminosäuren mit 6-Aminoquinolyl-N-hydroxy succinimidylcarbamat (ACQ) für die Proteinanalyse.

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( Archiv: Vogel Business Media )

In den vergangenen Jahren haben sich für die Analyse von Aminosäuren die Methoden der Vordersäulen-derivatisierung mit anschließender Auftrennungen derselben durch Reversed-Phase-Chromatographie immer mehr gegenüber der klassischen Methode durchgesetzt. Dieser Beitrag beleuchtet die einzelnen Techniken und beschreibt dann die Vordersäulen-derivatisierung der Aminosäuren mit 6-Aminoquinolyl-N-hydroxy-succinimidylcarbamat (ACQ) für die Proteinanalyse.

Bei der klassischen Methode werden sämtliche Aminosäuren underivatisiert durch Ionenaustauschchromatographie getrennt und anschließend bei erhöhter Temperatur mit Ninhydrin umgesetzt [1]. Der Vorteil dieser Methode ist neben ihrer Robustheit ihre hohe Auflösung. Das zur Steigerung der Empfindlichkeit statt Ninhydrin für die Nachdersäulenderivatisierung verwendete Fluorescamin konnte dieses jedoch nicht verdrängen [2]. Die Analysenverfahren der Vordersäulenderivatisierung mit anschließender Auftrennung der Aminosäuren durch Reversed-Phase-HPLC sind in der Regel zwar die schnelleren und empfindlicheren Techniken, jedoch konnten sich weder die Derivatisierung mit 1-Dimethyl-aminonaphthalin-5-sulfonylchlorid, DANS-Cl [3] oder Dimethylaminoazobenzolsulfonylchlorid, DABS-Cl [4], noch mit Phenylisothiocyanat, PITC [5, 6] durchsetzen.

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Nachteile und VorteileDie Vordersäulenderivatisierung der Aminosäuren mit ortho-Phthaldialdehyd, OPA, ist eine der modernsten Techniken [7]. Sie zeichnet sich vor allem durch hohe Empfindlichkeit von unter 10 fMol und sehr kurze Analysenzeiten aus [8]. Von großem Nachteil ist jedoch, dass ortho-Phthaldialdehyd nicht mit sekundären Aminen wie Prolin oder Hydroxyprolin reagiert [9]. Besonderes Interesse findet jedoch die hochempfindliche Analyse der enatiomeren D- und L-Aminosäuren in Nahrungsmitteln durch vollautomatische Vordersäulenderivatisierung mit OPA und N-Isobutyryl-cystein [10, 11].

Um die erwähnten Nachteile bei der Analyse von Proteinhydrolysat, zerebrospinaler Flüssigkeit, Serum, Seewasser etc. zu umgehen, beschrieben 1983 B. Josefsson et al. erstmalig die Derivatisierung der Aminosäuren mit 9-Fluorenyl-methoxycarbonyl-chlorid, FMOC [12, 13]. Das zur völligen Umsetzung der Aminosäuren notwendige, im Überschuss zugesetzte, jedoch die Auswertung der Chromatogramme störende FMOC kann einfach durch Zugabe von 1-Amino-adamantan gebunden werden [14]. Ein weiterer, besonders hervorstechender Vorteil dieser Methode ist, dass nach Ersetzen des FMOC’s durch sein chirales Analogon (+)-1-(9-Fluorenyl)ethylchloroformat leicht Probengemische enantiomerer Aminosäuren und Amine analysiert werden können [15].

Da jede der kurz erwähnten Methoden im Vergleich mit jeder anderen nicht nur mehr oder weniger Vorteile, sondern auch Nachteile hat, ist es bis dato unumgänglich für die jeweilige Problemstellung die jeweils optimale Methode auszusuchen. Weil jedoch Erforschung und Diagnose z.B. der Alzheimer’schen- und anderer schwerwiegender, vielfach genetisch bedingter Krankheiten [16] ebenso wie die Analyse von Proteomen immer höhere Empfindlichkeit bei stets nur minimalen zur Verfügung stehenden Probenmengen erfordern, war es das Ziel der im Folgenden beschriebenen Experimente, die für Standard- bzw. analytische HPLC bereits beschriebene Vordersäulenderivatisierung der Aminosäuren mit 6-Aminoquinolyl-N-hydroxy-succinimidyl-carbamat (AQC) weiter zu entwickeln [17]. Die neue Methode sollte robust, manuell und automatisch einfach zu handhaben und zumindest so empfindlich wie die Derivatisierung mit OPA oder FMOC sein. Dies wiederum bedeutet, sie muß „nano- und Kapillar-HPLC-tauglich“ sein und den Erfordernissen moderner Analysen von Proteomen genügen [18].

Diskussion und Ergebnisse

Da es das erklärte Ziel war, eine einfach Hand zu habende, zuverlässige Methode zur Aminosäurenanalyse in der Proteomforschung zu entwickeln, wurde besonders nach für diese Applikation geeigneten stationären Phasen gesucht, die auch gepackt als Kapillarsäulen kommerziell erhältlich sind. Es waren zwar zunächst für Standardanalysen DeltaChrom-AQC Säulen - 5 µm (250 x 4mm) von Watrex verwendet worden (Abb. 1 und 2), jedoch wurden um die Empfindlichkeit der Analysen zu steigern nach einem Screening mehrerer stationärer Phasen Narrowbore- und Kapillarsäulen ausschließlich gepackt mit Grom Saphir C18 - 3 µm (150 x 2 mm bzw. 150 x 300 µm) verwendet.

Obgleich die chromatographischen Bedingungen wie Säulenlänge 15 cm, Partikelgröße 3 µm, Elutionspuffer 50 mM Na-Acetat pH 5,75 bzw. 6,0 und Temperatur 45 °C optimiert worden waren, konnten mit der Grom Saphir C18-Phase jedoch keine zufriedenstellende Analysenzeiten (ungefähr 60 min) erzielt werden (s. Abb. 3). Deshalb wurde diese durch Grom Saphir C8 ersetzt und so die Analysenzeiten auf unter 20 Minuten verkürzt (s. Abb. 4). Auf eine weitere Verkürzung der Analysenzeit durch Ersetzen der 15 cm langen HPLC-Säulen durch Säulen der Länge 12,5 cm war für die Routine verzichtet worden, da die neue Methode robust und sicher sein sollte. Um vor allem aber die Derivatisierung selbst beziehungsweise vollständige Durchmischung kleinster Volumnia (unter 2 µL) von Probe, Reagenz und Puffern optimieren zu können, wurde die Stabilität der derivatisierten Aminosäuren nicht nur bei 4 °C, sondern auch bei Raumtemperatur untersucht.

Es konnte gezeigt werden, dass die Aminosäuren nach ihrer Derivatisierung mit AQC, aufbewahrt im Karusell eines Autoinjektors über 15 Stunden bei Raumtemperatur (Abb. 5) und bei 4 °C z.B. aufbewahrt in einem Autosampler sogar über 14 Tage (Abb. 6) stabil sind. Abbildungen 7 und 8 bestätigen wie erwartet, dass Fluoreszenz- etwa fünfzig- bis einhundertmal empfindlicher ist als UV-Detektion. Dies ist bei Fluoreszenzdetektion jeweils vor allem abhängig von dem durchstrahltem Volumen und bei UV-Detektion von der Schichtdicke der verwendeten Durchflusszellen, nicht aber von den Dimensionen der für den Vergleich eingesetzten HPLC-Säule.

Dennoch ermöglicht die Verwendung einer Kapillarsäule (300 µm ID) und eines entsprechenden UV-Detektors statt einer Narrowbore-Säule (2 mm ID) und eines Fluoreszenzdetektors gleich hohe Empfindlichkeit für die Analyse der Aminosäuren, nämlich etwa 100 fmol (Abb. 9). Wird jedoch diese Kapillarsäule nochmals z.B. gegen eine Nano-HPLC-Säule (50 µm ID) ausgetauscht, so ist eine weitere Erniedrigung des Detektionslimits um ungefähr das vierzigfache zu erwarten.

Für die Analyse von Proteomen ist neben der hohen Empfindlichkeit die nur geringe, für die Analyse zur Verfügung stehende Probenmenge bzw. das sehr kleine Probenvolumen, das für die Injektion auf eine Kapillar-HPLC-Säule benötigt wird, ein weiterer außerordentlicher Vorteil. Mit einem geeigneten Autosampler können diese Vorteile voll ausgeschöpft werden (s. Abb. 10). Die Genauigkeit dieser modernen Methode, sowie die Trennung der Derivate durch Nano- oder Kapillar-HPLC, stehen den anderen Methoden nicht nach, sondern scheinen sogar diesen nicht nur wegen ihrer wesentlich einfacheren Handhabung überlegen zu sein.

Zusammenfassung

Die beschriebene Methode der Vordersäulenderivatisierung mit AQC zur Analyse von Aminosäuren zeichnet sich besonders vor allen anderen, kurz erwähnten Techniken durch ihre einfache Handhabung aus. Dies liegt u.a. darin begründet, dass die gebildeten Derivate wesentlich stabiler sind als die vergleichbarer Methoden. Ferner kann bei UV-Detektion der AQC-Derivate die Nachweisgrenze durch Einsatz von Kapillarsäulen (300 µm ID) statt analytischer Säulen (4,0 bzw. 4,6 mm ID) mehr als zweihundertfach erniedrigt werden. Dieses Ergebnis kann mit Nano-HPLC-Säuen (kleiner 100 µm ID) noch wesentlich verbessert werden.

Die nach Vordersäulenderivatisierung von Aminosäuren mit AQC mit Kapillarsäulen und UV-Detektion erzielte Empfindlichkeit entsprechender Analysen ist also mindestens eben so hoch wie die mit analytischen Säulen und Fluoreszenzdetektion erzielte von OPA- und FMOC-Derivaten. Die UV-Detektion bietet gegenüber der Fluoreszenzdetektion noch einen weiteren beachtlichen Vorteil, nämlich dass Tryptophan ebenfalls hochempfindlich bestimmt werden kann. Dies ist wegen der intramolekularen Fluoreszenzlöschung ansonsten nicht möglich.

Die skizzierten Ergebnisse unterlegen wegen der erzielten, hohen Empfindlichkeit und der einfachen Handhabung somit den Schluss, dass im direkten Vergleich mit anderen Methoden die Derivatisierung der Aminosäuren mit AQC mehr Vorteile als jene hat.

*J. Naidanow, Abt. f. Biotechnologie, Hochschule Niederrhein, Krefeld **L. Minárikova, Abt. f. Molekulare Biologie, Karls-Universität, Prag/Tschechische Republik ***G. Barka, SunChrom, 61381 Friedrichsdorf ****P. Földi, GROM Chromatography GmbH, Rottenburg-Hailfingen

Materialien und Methoden

Die Analysen der human Plasma-, Biopsie-und Hefeextraktproben wurden mit einem HPLC-System bestehend aus folgenden Komponenten durchgeführt: Delta-Chrom SDS150 (master) und SDS15s (slave) Pumpe (Hochdruckgradient/Watrex Prague, Czech Republic), Midas Autosampler (Spark, Holland), 1040 HP Fluoreszenz-Detektor (Agilent Technologies), and EZ-Chrom-Datastation (Scientific Software, USA). Für die Mikrobore- und Narrowbore-Chromatographie stand ein HPLC-System von Thermo Electron zur Verfügung. Dies bestand aus einer HPLC-Pumpe Modell P 4000, einem Autoinjektor/Säulenthermostaten Modell AS 3000, einem UV-Detektor Model Spektra Focus (Flusszelle 1,3 µL/Schichtdicke 3 mm) und einem Fluoreszenzdetektor Modell FL 2000 (Flusszelle 3 µL/2 mm).

Die Datenerfassung und Steuerung der Anlage erfolgte mit einem mit AMD Athlon/1000 MHz Mikroprozessor ausgestatteten PC und Software ebenfalls von Thermo Electron. Das für die Nano- und Kapillar-Säulen verwendete HPLC-System der Firma Sunchrom bestand aus der Kapillar-HPLCPumpe Modell MicroPro (Spritzenvolumen 2 mL), wahlweise einem manuellen Mikroinjektionsventil Modell Upchurch Scientific M 435 oder aber für die automatische Derivatisierung aus einem Autosampler Modell Endurance, einem UV Detektor Modell Spectraflow 501 ausgestattet mit einer 45 nL Flusszelle (Schichtdicke 1 cm). Gesteuert wurde das System bzw. die Daten erfasst mit der Chromstar Software 6.0, ebenfalls von Sunchrom. Alle Eluenten wurden stets kontinuierlich mit Helium begast.- Hefezellen: Zwei oder drei Hefekolonien wurden in 3 ml Wasser suspendiert. Anschließend wurden die Aminosäuren nach der durch D.P. Gent und J.C.Slaughter modifizierten Methode von Y.Ohsurni et al. extrahiert [19, 20].- Kolonzellgewebe: 10–30 mg Kolongewebe wurde zehn Minuten lang in 200 ml Wasser bei 50°C inkubiert. Die Mischung wurde kurz zentrifugiert, und 100 µl des Überstandes mit 400 ml Acetonitril versetzt. Dieser Extrakt wurde intensiv geschüttelt (Vortex) und zehn Minuten lang bei 10 000 x g zentrifugiert. Die als Standards verwendeten Aminosäuren wurden von Serva, Heidelberg, bezogen, Elutions- bzw. Lösungsmittel (HPLC grade), sowie Puffersubstanzen (p.a.) hingegen von Merck, Darmstadt. Narrowbore- (150 x 2 mm) und Kapillarsäulen (150 mm x 300 µm) gepackt mit Grom Saphir C18 bzw. C8 - 3 µm warenvon der Firma Grom zur Verfügung gestellt worden, die analytischen HPLCSäulen (Watrex 250 x 4 mm Amino Acid-AQC 5 µm mit 20 x 4 mm Vorsäule) und das Derivatisierungsreagenz AQC jedoch von Watrex Praha s.r.o. Alle Aminosäurenstandards und -proben wurden nach einer Vorschrift ebenfalls von Watrexderivatisiert [21].

Literatur:[1] D.H. Spackman, W.H. Stein, S. Moore, Anal. Chem. 30,1190 – 1205 (1958)[2] S. Udenfriend, S. Stein, P. Böhlen, W. Dairman, W. Leimgruber, M. Weigele, Science 178, 871 – 872 (1972)[3] W. Tapuhi, D.E. Schmidt, W. Lindner, B.L. Karger, Anal. Biochem. 115, 123 – 129 (1981)[4] J.Y. Chang, P. Martin, R. Bernasconi, D.G.Braun, FEBS Lett. 132, 117 – 120 (1981)[5] R.L. Heinrickson, S.C.Meredith, Anal. Biochem.136, 65 – 74 (1983)[6] B. Bidlingmeyer, S.A. Cohen, T.L. Tarvin, J. Chromatogr. 336, 93 – 104 (1984)[7] W.D. Hill, F.H. Walters, T.D. Wilson, J.D.Stuart, Anal. Chem. 51, 138 – 1341 (1979)[8] Th. Graser, H. Godel, P. Földi, P. Fürst, Anal. Biochem. 151, 142 – 152 (1985)[9] H. Godel, Th. Graser, P. Földi, P. Fürst, J.Chromatogr 297, 49 – 61 ( 1984)[10] H. Brückner, P. Jack, M. Langer, H. Godel,Amino Acids 2, 271 – 284 (192)[11] H. Brückner, T. Westhauser, Chromatographia 39, 419 – 426 (1994) [12] S. Einarsson, B. Josefsson, S. Lagerkvist, J. Chromatogr. 282, 609 – 618 (1983) [13] S. Einarsson, S. Folestad, B. Josefsson, S.Lagerkvist, Anal. Chem. 58, 1638 – 1643 (1986)[14] I. Betnér, P. Földi, LC + GC Magazine 6, 832– 840 (1988) [15] S. Einarsson, B. Josefsson, Anal. Chem. 59,1191 – 1195 (1987)[16] G. Thorsén, J. Bergquist, A. Westlind-Dabielsson, B. Josefsson, Anal. Chem 73, 2625 – 2631 (2001)[17] S.A. Cohen, D.P. Michaud, Anal. Biochem. 211, 279 – 287 (1993)[18] C. Klein, P. Földi, LaborPraxis 2, 34 - 36 (2002) [19] D.P. Gent, and J.C. Slaughter, J, Appl. Microbiol. 84, 752-758 (1998)[20] Y. Ohsumi, K. Kitamoto and Y. Anraku, 170, 2676-2782 (1988)[21] Vorschrift zur Derivatisierung v. Aminosäuren mit AQC, Watrex Praha s.r.o., Prag (2004)

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