gesponsertZellzahl und Zellkonfluenz – einfach immer im Blick Künstliche Intelligenz in der Zellkultur

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Carl Zeiss Microscopy GmbH Bio Science Jena (MS)

Die Untersuchung von Zellkulturen mithilfe mikroskopischer Verfahren ist oftmals eine zeitaufwändige und fehleranfällige Aufgabe. Künstliche Intelligenz und Automatisierung können Anwendern dabei helfen, schneller und besser zu mikroskopieren.

Zellkultur ist die Grundlage vieler Experimente in der Zellbiologie und begleitet die Laborroutine. Die optische Vergrößerung der zellulären Prozesse und Strukturen mit verschiedenen Mikroskopietechniken ist dabei notwendige Voraussetzung für die Zellbiologie. Dabei kann entweder mit Modellorganismen oder Zellkulturen gearbeitet werden. Die Vorteile der Arbeit mit Zellkulturen gegenüber komplexeren Modellorganismen liegen auf der Hand: In der Zellkultur sind die meisten Parameter des Experiments wie Sauerstoffgehalt, Temperatur, Feuchtigkeit etc. sowie die spezifische Behandlung plan- und durchführbar, so dass sie reproduzier- und kontrollierbar sind.

Die tägliche Arbeit im Zelllabor besteht zum Großteil aus Vorbereitung und Pflege. Für die tägliche Arbeit müssen Zelllinien hergestellt, kultiviert und für Experimente vorbereitet werden. Um normales physiologisches Wachstum zu gewährleisten sowie auf ungewöhnliche Morphologie und mögliche Verunreinigungen hin zu überprüfen, müssen Zellen täglich mikroskopisch hinsichtlich Wachstumsrate und Zelldichte im Kulturgefäß beurteilt werden. Dies erfordert Know-how, basierend auf Erfahrung.

Ein typischer Arbeitsablauf in einem zellbiologischen Labor, sei im folgenden anhand des Herstellens einer LLC-PK1-Zellkultur für eine Anwendungsstudie, dargestellt.

Anlegen einer Zellkultur aus gefrorenen Zellen

LLC-PK1-Zellen werden im Wasserbad bei 37 °C aufgetaut und in ein steriles Reagenzglas mit Zellkulturmedium überführt. Anschließend werden die Zellen für ca. fünf Minuten bei 900 UpM zentrifugiert. Der Überstand muss zunächst verworfen werden. Das Pellet oder Teile davon können dann resuspendiert und in einen T75-Kulturkolben mit ca. 10 ml Kulturmedium überführt werden. Die Kulturflasche wird nun in einem Inkubator bei 37 °C, 5 % CO₂ und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 97 % inkubiert. Nach 24 Stunden Bebrütung wird das Kulturmedium gegen neues Medium ausgetauscht.

Gesundheitscheck und Prüfen auf Kontaminationen

Das Wachstum und die Morphologie der Zellen werden täglich mithilfe der Phasenkontrastmikroskopie überwacht. Bei der Arbeit mit Zellkulturen können verschiedene Kontaminationen auftreten – am häufigsten durch Schimmelpilze, Hefen und Bakterien. Eine besonders ungünstige Form der bakteriellen Kontamination kann durch Mykoplasmen verursacht werden. Im Vergleich zu anderen Bakterien fehlt diesen sehr kleinen prokaryotischen Organismen eine Zellwand und sie sind schwer zu erkennen. Morphologische Unregelmäßigkeiten und die Farbe des Nährmediums können ein erster Hinweis auf eine ungesunde Zellkultur sein.

Subkultivierung bei bestimmten Konfluenzgrad und Zellzählung

Werden keine morphologischen Auffälligkeiten oder Kontaminationen festgestellt, werden die Zellen in Zellkulturflaschen weiter kultiviert, bis sie die für die jeweilige Zelllinie erforderliche Dichte (Konfluenz) für das Splitten erreicht haben. Je nach Zelllinie und verwendetem Medium können die Wachstumsraten unterschiedlich sein.

Für die meisten der häufig verwendeten Zelllinien ist eine Konfluenz von 70 bis 80 % erforderlich, bevor die Zellen gesplittet und für weitere Experimente passagiert werden können. Das Splitten der Zellen bei einer bestimmten Konfluenz ist entscheidend für das Ergebnis der Experimente und deren Reproduzierbarkeit. Sobald der entsprechende Konfluenzgrad im Kulturgefäß erreicht ist, müssen die Zellen also auf verschiedene Zellgefäße aufgeteilt werden. Eine zu frühe oder zu späte Teilung kann zu uncharakteristischem Zellverhalten oder reduziertem Kulturwachstum führen.

Jede Zelllinie hat ihre spezifische Anzahl von Zellen, die in ein bestimmtes Volumen von Medium ausgesät werden muss, um optimale Wachstumsbedingungen zu erreichen. Dazu müssen die adhärenten Zellen zunächst z. B. mit Trypsin von der Bodenfläche des Kolbens abgelöst werden. Nach dem Ablösen werden die Zellen in einem definierten Volumen des Nährmediums resuspendiert. Durch Messung eines kleinen Aliquots der Suspension lässt sich die Zellkonzentration mithilfe eines Mikroskops in Phasenkontrast bestimmen. Das richtige Volumen der Suspension wird dann auf verschiedene Zellkulturflaschen verteilt, mit frischem Nährmedium aufgefüllt und in einem Inkubator zum Wachsen gebracht.

Traditionell wird die Zellzählung manuell mit einem Hämozytometer (beispielsweise mit einer verbesserten Neubauer-Zählkammer) durchgeführt. Die Zellen in den vier Eckquadraten (jedes ist 1 mm x 1 mm groß) können im Phasenkontrast gezählt werden. Die Konzentration (MV) oder Gesamt-Anzahl der Zellen pro Milliliter wird wie folgt berechnet: MV = [(Gesamtzahl der in vier Quadraten gezählten Zellen / 4) x Verdünnungsfaktor x Kammerkonstante] pro ml. Eine typische Kammerkonstante ist etwas 10⁴.

Zellzahl und Zellkonfluenz – entscheidende Größen, aufwändig zu bestimmen

Manuelle Zellzählungen sind arbeitsintensiv und fehleranfällig. Je nach der gewünschten Genauigkeit werden manchmal weniger als vier Quadrate gezählt und aufgrund des Zeitaufwands bei diesem Prozess finden in der Praxis häufig nur grobe, subjektive Abschätzungen statt. Doch Zellzahl und Zellkonfluenz sind generell wichtige Parameter bei der Arbeit mit adhärenten Zellkulturen wie COS-7, HeLa, LoVo und U2OS. Sie sind entscheidend, um die Vermehrung und Lebensfähigkeit von Zellen zu bestimmen, die Umgebungsbedingungen anzupassen, Zellen zu splitten oder zu passagieren, Transfektionen durchzuführen und Experimente vorzubereiten. Je weniger Varianz in der Zellzahl und der Zelldichte, umso besser sind die Voraussetzungen, ein hohes Level an experimenteller Reproduzierbarkeit zu erzielen. Denn es ist bekannt, dass zelluläre Reaktionen u. a. von der Zelldichte in der Kultur und dem Level an Zell-Zell-Kontakten abhängig sind.

Beide Werte – Zellkonfluenz und Zellzahl – müssen zudem unabhängig von Form, Größe und Typ der Zelle erfasst und ausgewertet werden können. Wer das manuell versucht, braucht viel Zeit, Geduld und Erfahrung. Darüber hinaus sind die Ergebnisse fehleranfällig und subjektiv. Automatisierung und Künstliche Intelligenz (KI) können hier eine wesentliche Erleichterung schaffen und sinnvolle Unterstützung sein.

Sinnvolle Unterstützung – per Künstlicher Intelligenz

Das neue All-in-One Cell Imaging System Zeiss Axiovert 5 digital unterstützt Arbeitsabläufe mittels KI. Von der Laborroutine bis zur Grundlagenforschung, vom Phasenkontrast bis zur Mehrkanal-Fluoreszenzbildgebung – das System ermöglicht Bildaufnahmen und quantitative Analysen mit nur einem Klick. Um die Anzahl der Zellen und die zellbedeckte Fläche automatisch direkt im Kulturgefäß zu analysieren, stehen die Zeiss Module AI Cell Confluency und AI Cell Counting zur Verfügung. Sie fügen sich nahtlos in jeden Arbeitsablauf ein. Mikroskopie-Bilder werden auf Knopfdruck automatisch analysiert. Das Ergebnis wird umgehend angezeigt – visuell und quantitativ.

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Durch den Einsatz von KI zur automatischen Zellanalyse direkt im Kulturgefäß, wird die Wachstumsrate der Zellen nicht durch unnötiges Handling beeinflusst. Das sorgt nicht nur für ein möglichst physiologisches Verhalten der Zellen sondern spart auch Zeit durch eine höhere Ausbeute. Da Labscope AI Cell Counting den Einsatz einer Zell-Zählkammer ersetzt, kann darüber hinaus viel Zeit und Arbeit für manuelles Zählen eingespart werden. Im Labor ist das Zeit, die für sinnvollere Tätigkeiten genutzt werden kann. Die automatische Zellzählung der Zellen eines jeden Zellstapels erfolgt mittels Phasenkontrastmikroskopie in Sekundenschnelle. Dabei lässt sich die Zellzahl in einem Sichtfeld mit nur einem Klick messen. Wird dieser Vorgang an mehreren Positionen in der Probe wiederholt, entsteht eine gemittelte und hochgerechnete Gesamtzellzahl für dieses Zellkulturgefäßes.

Ebenso erleichtern die Zeiss Labscope AI Module das Training neuer User und gewährleisten eine standardisierte Bewertung der Zellkultur, egal welcher Mitarbeiter die Zellkultur durchführt. Der Anwender erhält also mehr Usability bei gleichzeitig höherer Genauigkeit und Reproduzierbarkeit seiner Ergebnisse – und das All-in-One mit nur einem System.

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