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Mikroskopie Ratiometrische Messung der intrazellulären Sauerstoffverteilung

| Redakteur: Dr. Ilka Ottleben

Vom Zellstoffwechel bis hin zur Krebsforschung – die Kenntnis der Sauerstoffverteilung in einer Zelle trägt zum Grundverständnis entscheidender zellulärer Prozesse bei und könnte die Krebsdiagnostik erleichtern. Eine neue ratiometrische Technik basiert auf speziellen Indikatorkügelchen.

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Abb. 1: Schemazeichnung der RGB-PEBBLEs zur ratiometrischen Messung von Sauerstoff. (Bild: H.-H. Gorris/ Uni Regensburg)
Abb. 1: Schemazeichnung der RGB-PEBBLEs zur ratiometrischen Messung von Sauerstoff. (Bild: H.-H. Gorris/ Uni Regensburg)

Sauerstoff ist lebensnotwendig für die meisten Lebewesen, einschließlich des Menschen. Die Verfügbarkeit von Sauerstoff ermöglicht Atmung und Stoffwechsel in jeder einzelnen Zelle. Um diese Schlüsselprozesse besser zu verstehen, ist ein lokaler Nachweis von Sauerstoffverteilung und -verbrauch in den Zellen erforderlich. Herkömmliche Messmethoden für Sauerstoff, wie etwa die Clark-Elektrode sind jedoch zu groß für intrazelluläre Messungen und erlauben zudem nur punktuelle Messungen. Als Alternative werden molekulare Indikatoren verwendet, deren Lumineszenz in Gegenwart von Sauerstoff gelöscht wird, sodass sich die Sauerstoffkonzentration durch die Intensität der Lumineszenz bestimmen lässt: Je mehr Sauerstoff vorhanden ist, desto geringer ist die Lumineszenz des Indikators.

Solche Indikatoren werden nicht nur für Sauerstoff, sondern beispielsweise auch für den Nachweis von Protonen (pH-Wert), Ca2+, Mg2+ und anderen Metallionen verwendet. Nach Einschleusen in die Zellen können die Indikatoren mithilfe eines Mikroskops beobachtet werden, haben aber den Nachteil, dass sie an Zellbestandteile binden, was die Messung erschwert, wenn nicht gar unmöglich macht.

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Diese Einschränkungen molekularer Sauerstoff-Indikatoren wurden umgangen, indem der empfindliche Sauer- stoff-Indikator Platin(II)-meso-tetrakis-(pentafluorphenyl)porphyrin (PtTF20PP), (s. Abb. 2), in Polystyrolkügelchen mit einem Durchmesser von 100 nm oder 500 nm eingeschlossen wurde [1]. Darüber hinaus wurde ein Derivat von 4-Amino-1,8-naphtalimid als Referenzfarbstoff verwendet, der gegenüber Sauerstoff unempfindlich ist. Solche Indikatorkügelchen werden im Englischen auch als „PEBBLEs” (Probes Encapsulated By Biologically Localized Embedding) bezeichnet (s. Abb. 1) [2]. Aufgrund seiner Hydrophobie eignet sich Polystyrol gut zur Einbettung der beiden hydrophoben Farbstoffe. Die Oberfläche der Polystyrolkügelchen trägt Aminogruppen, sodass sie gut in Wasser dispergierbar sind. Polystyrol ermöglicht die selektive Diffusion von Sauerstoff und schützt die Farbstoffe vor Interaktionen mit Protonen oder Zellbestandteilen, die das Signal der Farbstoffe beeinflussen könnten. Sauerstoff-Indikator und Referenzfarbstoff können beide mit blauem Licht angeregt werden, unterscheiden sich aber in ihrer Lumineszenz. Die rote Lumineszenz des Sauerstoff-Indikators und die grüne Lumineszenz des Referenzfarbstoffs werden auf zwei getrennten Kanälen digitaler RGB-Kameras aufgenommen. Die Indikatorkügelchen werden dementsprechend als „RGB-PEBBLEs“ bezeichnet.

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