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Raman-Mikroskopie So gelingt die automatisierte Partikel-Analyse mit Raman-Mikroskopie

| Autor/ Redakteur: Miriam Böhmler*, Wolfram Ibach*, Damon Strom*, Karin Hollricher*, Eleni Kallis* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Mikropartikel gibt es fast überall in der Umwelt. Besonders Mikroplastik wird zunehmend zum Problem. Der quantitative und qualitative Nachweis der Partikel ist kompliziert. Witec bietet ein Software-Paket zur automatischen Erkennung und Lokalisierung, strukturellen Klassifizierung und chemischen Analyse von Mikropartikeln.

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Das Raman-Mikroskop alpha 300R und die Software Particlescout sind die optimale Kombination zur Analyse von Mikropartikeln.
Das Raman-Mikroskop alpha 300R und die Software Particlescout sind die optimale Kombination zur Analyse von Mikropartikeln.
(Bild: Witec; ©Africa Studio - stock.adobe.com_[M]-Kübert)

Abiotische Mikropartikel finden sich in alltäglichen Produkten wie Nahrungsmittel, Kosmetik oder Farbe. Sie werden auch zur fälschungssicheren Kennzeichnung von Produkten verwendet. Mikroplastikpartikel, die durch die Zersetzung von Plastikmüll entstehen, findet man überall in der Umwelt; sie belasten Menschen und Tiere [1]. Laut IUPAC sind Mikropartikel zwischen 0,1 µm und 100 µm groß [2]. Andere Definitionen beinhalten Teilchen bis zu 5 mm [1]. Der Nachweis von Mikropartikeln in Proben ist nicht trivial. Man muss - im Vergleich zu den Partikeln – große Probenbereiche absuchen und dabei selbst winzigste Teilchen lokalisieren [1]. Insbesondere in Umweltproben ist nur ein Bruchteil der vorhandenen Partikel tatsächlich von Interesse. Diese muss man also vor der Analyse erst identifizieren.

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Konfokale Raman-Mikroskopie

Das Raman-Spektrum einer chemischen Substanz ist so einzigartig wie ein Fingerabdruck und kann die Inhaltsstoffe einer Probe identifizieren. Der Raman-Effekt basiert auf inelastischer Lichtstreuung an Molekülen. Das gestreute Licht hat eine andere Energie als das Anregungslicht, was im Raman-Spektrum sichtbar ist. Durch die Kombination eines Konfokalmikroskops mit einem Spektrometer kann an jedem Bildpunkt ein komplettes Raman-Spektrum aufgenommen werden [7]. Das Raman-Bild zeigt die räumliche Verteilung der Komponenten. Aus 2D-Raman-Bildern von verschiedenen Fokalebenen können 3D-Bilder generiert werden (ein Beispiel in Abb. 5).

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Manuelle Partikelanalysen sind aufwändig und fehleranfällig [3]. Daher werden dringend automatisierte und standardisierte Prozesse benötigt, um alle Partikel zu lokalisieren, die interessanten auszuwählen und sie zuverlässig strukturell und chemisch zu charakterisieren [1, 3, 4, 5, 6]. Die gesamte Untersuchung sollte möglichst wenig Zeit in Anspruch nehmen und übersichtliche Informationen über die Probeneigenschaften liefern. Witec Particlescout erfüllt diese Anforderungen.

Automatisierte Partikel- Analyse mit Raman-Imaging

Am Beispiel einer Mischung von Plastikpartikeln wird gezeigt, dass konfokale alpha300 Raman-Mikroskope (Witec), die mit der Particlescout Software ausgestattet sind, sämtliche Schritte einer umfassenden Partikelanalyse inklusive Berichterstattung weitestgehend automatisch durchführen können.

  • Kleine Partikel in großen Proben erkennen und lokalisieren: Bei der Partikelsuche wird zunächst ein Weißlichtbild aufgenommen, auf dem die Partikelumrisse erkennbar sind. Ein Dunkelfeldbild liefert dabei oft besseren Kontrast als ein Hellfeldbild (s. Abb. 1A, B). Um selbst kleine Partikel zu detektieren, wird eine hohe Vergrößerung benötigt, weshalb mit jedem Bild nur ein kleiner Bereich der Probe dargestellt werden kann. Da die Partikel einer Probe in der Regel unterschiedlich groß und verschieden geformt sind, können nicht alle Teilchen gleichzeitig scharf abgebildet werden. Beide Probleme können durch Image Stitching und Focus Stacking gelöst werden, die in der Witec Control Software implementiert sind. Image Stitching verbindet die Aufnahmen verschiedener Probenbereiche zu einem großflächigen Übersichtsbild. Focus Stacking kombiniert Bilder aus verschiedenen Fokusebenen. So kann man mit den konfokalen Raman-Mikroskopen von Witec großflächige, scharfe und kontrastreiche Hellfeld- und Dunkelfeldbilder mit hoher Auflösung generieren (s. Abb. 1A, B). Particlescout erkennt die Partikel im lichtmikroskopischen Bild automatisch anhand eines gesetzten Helligkeits-Schwellenwerts.
  • Partikel strukturell klassifizieren: Die Positionen aller detektierten Partikel werden in Form einer Maske dargestellt (s. Abb. 1C). Eigenschaften wie Fläche, Umfang oder Äquivalentdurchmesser werden automatisch berechnet. Anhand ihrer strukturellen Merkmale lassen sich die Teilchen gruppieren. Jede weitere Analyse kann für alle Partikel durchgeführt oder auf einzelne Gruppen beschränkt werden. Für wiederkehrende Arbeitsabläufe können Filter vordefiniert und gespeichert werden.
  • Partikel chemisch analysieren mit Raman-Spektroskopie: Raman-Spektroskopie ermöglicht es, die chemischen Bestandteile von Materialien zu identifizieren, denn das Raman-Spektrum eines jeden Moleküls ist vergleichbar mit einem individuellen Fingerabdruck (siehe Infobox „Konfokale Raman-Mikroskopie“). Mit Particlescout werden Raman-Spektren an jeweils nur einem Punkt der ausgewählten Partikel gemessen, was sehr viel schneller ist, als ein komplettes Raman-Bild des Probenbereichs aufzunehmen. Dank der ausgezeichneten Lokalisierungseigenschaften der Witec-Mikroskope wird jeder gewählte Partikel extrem präzise vom Anregungslicht für die Raman-Messung angesteuert, so dass man selbst kleine Teilchen analysieren kann. Witec Raman-Mikroskope sind modulare Systeme, deren optische Komponenten perfekt aufeinander abgestimmt sind für höchste Signalsensitivität, optimale Bildgebung und schnelle Messungen. Ausgestattet mit Particlescout, kann man damit mehrere Hundert Partikel pro Stunde analysieren. Die molekulare Zusammensetzung der Teilchen kann anhand ihrer Raman-Spektren bestimmt werden (Abb. 1D, E). Dazu ist die leistungsstarke Datenbank-Software Truematch in Particlescout integriert. Truematch gleicht die gemessenen Spektren mit kommerziellen oder eigenen Datenbanken ab und identifiziert die gefundenen Partikel schnell und zuverlässig. So lassen sich die chemischen Materialeigenschaften der Partikel mit deren strukturellen Eigenschaften wie Umfang oder Fläche korrelieren. Particlescout bietet verschiedene Möglichkeiten zur Erstellung von detaillierten und übersichtlichen Berichten.

Die folgenden Bespiele veranschaulichen die Funktionen von Particlescout. Alle Messungen wurden an einem konfokalen alpha300 R Raman-Mikroskop (Witec) gemacht.

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