Wie von Zauberhand: Beschleunigte adaptive Laborevolution mikrobieller Produktionsprozesse

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LAB-SUPPLY

Forschungszentrum Jülich

Im Zuge der Anpassungen an die gewählten Stressbedingungen treten verstärkt Mutationen in spezifischen Genombereichen des Zielorganismus auf. Im Gegensatz zur gerichteten Stammkonstruktion besteht beim ALE-Verfahren nicht die Gefahr einer Verschlechterung der zellulären Fitness. Im Idealfall setzen sich diejenigen Mutationen durch, welche zu einer Fitnesser­höhung führen. Unter regulatorischen Aspekten ist anzumerken, dass die ausschließlich über ALE erzeugten Stammvarianten keine genetisch modifizierten Organismen sind (non-GMO). Neben der direkten Verwendung eines evolvierten Stammes für Produktionszwecke, können parallel die resultierenden Mutationen durch Genomsequenzierung identifiziert und als Grundlage für eine gerichtete Stammentwicklung genutzt werden [11].

Miniaturisierung und Automatisierung der Stammentwicklung

Zur Durchführung von ALE-Experimenten existieren mittlerweile eine Reihe verschiedener technologischer Ansätze, die sich neben der Betriebsweise vorrangig in der Größenskala der verwendeten Bioreaktoren unterscheiden.

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Zum einen können mittels kontinuierlicher Prozessführung im Laborbioreaktor Mikroorganismen im Fließgleichgewicht bei limitierter Zufuhr von Nährmedium sowie Ablauf von Zellen und (Neben)produkten über längere Zeit kultiviert werden. Die entsprechende Anpassung und Diversifizierung der Zellen kann dann in Abhängigkeit des gewählten Selektionsdruckes erfolgen, z.B. durch langsame Erhöhung der Konzentration einer spezifischen Me­dienkomponente im Zulauf des Bioreaktors. Eine grundsätzliche Herausforderung der kontinuierlichen Prozessführung mit gentechnisch veränderten Produktionsstämmen unter limitierenden Wachstumsbedingungen ist die Stabilität eingebrachter Plasmide [12], da jeglicher Plasmidverlust unmittelbar zum Verlust des Produktionsweges und damit zu einer überlegenen Fitness der plasmidfreien Zellen führt. Alternativ kann eine Erweiterung des klassischen Satzverfahrens (Batch) zur Laborevolution genutzt werden, indem einzelne Kultivierungsansätze solange sequentiell überimpft werden, bis die gewünschte Anzahl an Generationszyklen erreicht ist. Hier werden in der Regel alle wachstumsrelevanten Medienkomponenten im Überschuss bereitgestellt und damit die Gefahr eines Plasmidverlustes minimiert. Nachteilig ist der hohe manuelle Aufwand bei der fortlaufenden Überimpfung, sowie für das Monitoring von Biomasse und Produktbildung, wenn der Ansatz im klassischen Schüttelkolben durchgeführt wird.

Aus diesem Grund wird bereits intensiv an der Entwicklung verbesserter ALE-Methoden gearbeitet, wobei verschiedene Ansätze unter Nutzung von Techniken zur Miniaturisierung und Automatisierung verfolgt werden. In der Arbeitsgruppe Bioprozesse und Bioanalytik am Institut für Bio- und Geowissenschaften des Forschungszentrum Jülich wurde kürzlich eine bestehende Kultivierungsplattform mit bereits hohem Automatisierungsgrad („Mini Pilot Plant“) um weitere automatisierte Workflows zur ungerichteten Stamm­optimierung mittels ALE erweitert [13]. Durch Einsatz einer modularisierten Plattform, welche u.a. ein Mikrotiterplatten-basiertes Mikrobioreaktorsystem (z.B. Biolector, m2p-labs) mit einem Liquid Handling System (z.B. Freedom Evo, Tecan) verbindet, können so vollautomatisierte repetitive Batch-Kultivierungen durchgeführt werden (s. Abb. 2).

Die Vorbereitung verschiedener Medienzusammensetzungen, deren kühle Zwischenlagerung sowie die Inokulation der individuellen Kavitäten der Kultivierungsplatte im Mikrobioreaktor erfolgt direkt auf dem Roboterdeck durch entsprechende Liquid-Handling-Operationen. Die anschließende Überimpfung der hochgewachsenen Bakterienkulturen in frisches Medium (nächster Batch-Zyklus) erfolgt ebenfalls automatisiert durch einen zeitlichen Trigger oder unter Nutzung verfügbarer online Signale (z.B. Backscatter-Messung) der integrierten Kultivierungseinheit. Damit kann sichergestellt werden, dass sich die Kulturen zum Zeitpunkt der Überführung z.B. genau in der exponentiellen Wachstumsphase befinden. Dies stellt einen weiteren Vorteil gegenüber herkömmlichen manuellen ALE-Prozessen in Schüttelkolben oder Bioreaktoren ohne direkt nutzbare Online-Signale dar.

Unter Anwendung dieser neuen ALE-Technologie gelang es, einen zuvor konstruierten C. glutamicum-Stamm hinsichtlich seiner Assimilationseigenschaften für das C5-Kohlenhydrat D-Xylose deutlich zu verbessern (s. Abb. 3) [11, 13]. Darüber hinaus können mit diesem Ansatz neue Stammkonstrukte unter prozessrelevanten Bedingungen hinsichtlich Robustheit und Langzeitstabilität zuverlässig getestet werden [4].

Diese leistungsfähige Plattform zur Laborevolution wurde bisher im akademischen Umfeld entwickelt und angewendet. Im Rahmen des Microbial Bioprocess Lab (Mibiolab), sollen derartige Technologien für Fragestellungen mit klarer industrieller Ausrichtung zusammen mit Industriepartnern weiterentwickelt und erfolgreich angewendet werden. Das Mibiolab verfolgt den Ansatz eines Open Innovation Labs, d.h. eines Ermöglichungsraums, um neue Lösungen für relevante industrielle Herausforderungen und Fragestellungen zu entwickeln. Mibiolab bietet hierzu ein breites Spektrum an Kooperationsmöglichkeiten und Partnerschaften bis hin zu F+E Serviceaufträgen für industrielle und akademische Partner an.

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