Allergieauslösern mit der MS auf der Spur

Anbieter zum Thema

Shimadzu Deutschland GmbH

Gerstel GmbH & Co. KG

SIM Scientific Instruments Manufacturer GmbH

AB SCIEX Germany GmbH

phenomenex LTD

Um unterschiedliche potenziell allergene Proteine simultan und mit hoher Sensitivität und Zuverlässigkeit nachweisen zu können, haben Wissenschaftler von AB Sciex in Zusammenarbeit mit verschiedenen Lebensmittelkontroll-Laboren einen auf Massenspektrometrie beruhenden Assay entwickelt [3]. Er beinhaltet die Festphasenextraktion zur Probenvorbereitung, die anschließende LC-MS/MS-Analyse mittels Multiple Reaction Monitoring (MRM) zur Quantifizierung sowie MS/MS-Spektren zur Identifizierung des detektierten Allergens.

LC-MS/MS – Allergene simultan quantifizieren

Die Proben wurden mittels Festphasenextraktion mit Kartuschen der Firma Phenomenex extrahiert [4, 5]. Für die Flüssigchromatographie (LC) wurde ein Shimadzu-UFLC-System mit einer polar modifizierten RP-Säule verwendet [6]. Im Zuge der Methodenentwicklung wurden die MRM-Übergänge ermittelt, die zum MS/MS-Nachweis der Allergene herangezogen werden können. Für alle massenspektrometrischen Analysen nutzten die Wissenschaftler ein AB Sciex 4000 QTRAP LC-MS/MS-System mit Elektrospray-Ionisierung (ESI). Ein wichtiges Tool zur massenspektrometrischen Analyse war der Midas-Workflow der MRM-Pilot-Software. Er diente dazu, die MRM-Übergänge anhand der bekannten Proteinsequenzen zu bestimmen. Mithilfe der MRM-Übergänge konnten dann Qtrap-MS/MS-Spektren angefordert werden. Um die identifizierten Peptide und die Eignung der MRM-Übergänge für den Allergennachweis zu bestätigen, wurden die Messwerte schließlich in eine Datenbank-Suchmaschine eingegeben – ein Ansatz, der ohne den Einsatz synthetischer Peptide zur Verifizierung auskommt.

Essenziell für den Erfolg der Assayentwicklung war die große Sorgfältigkeit bei der Auswahl der Peptide: Jedes durfte nur in einem einzigen Allergen vorhanden sein und Peptide, die anfällig für Modifikationen waren (z.B. durch Prozessieren oder Lagern der Lebensmittel), wurden nicht in die Analyse einbezogen.

Scheduled MRM für höhere Sensitivität

Um Multiple Reaction Monitoring auf den erwarteten Retentionszeitpunkt der jeweiligen Substanz zu fokussieren, nutzten die Wissenschaftler den Scheduled MRM-Algorithmus, der die Zahl der konkurrierenden MRM-Übergänge reduziert (s. Abb. 2). Das erhöht einerseits die Sensitivität der Messung, andererseits lässt dieser Ansatz dem Anwender die Option offen, für künftige Analysen zusätzliche Allergene in die Methode einzuschließen. Vier Nahrungsmittelallergene (Milch, Ei, Weizen und Erdnuss) wurden sowohl in Brot als auch in Pasta getestet. Abbildung 3 zeigt das Ergebnis des Midas-Workflows am Beispiel von Milch- und Ei-Peptiden: Zunächst wurden bestimmte MRM-Übergänge gemessen, mit deren Hilfe die abhängigen MS/MS-Spektren angefordert werden konnten. Auf diese Weise konnte jedem der Proteine ein individuelles Peptidmuster zugeordnet werden, wobei dieselben Peptide in unterschiedlichen Proben (Brot oder Pasta) wie zu erwarten identische MS/MS-Spektren erzeugten.

Um zu prüfen, innerhalb welchen Konzentrationsbereiches sich mit dem neuen Assay zuverlässig Messungen durchführen lassen, wurden die Testproben mit verschiedenen Konzentrationen an Milch- bzw. Ei-Proteinen versetzt und in Mehrfachmessungen analysiert.

Abbildung 4 (online) zeigt das Ergebnis dieser Kalibration bei Peptiden aus Ei und Milch: bis zu einem Konzentrationsbereich von 2 ppm (Milch) bzw. 5-10 ppm (Ei) war eine lineare Abhängigkeit messbar. Interne Standards wurden hierfür nicht benötigt.

Somit waren die Sensitivitäten der LC-MS/MS-Methode vergleichbar mit denen herkömmlicher ELISA- und Real-Time-PCR-Techniken. Die Standardabweichungen der Einzelmessungen lagen im niedrigen Konzentrationsbereich sogar signifikant unter denen der ELISA-Tests. Für Milch-Peptide betrug der CV weniger als 5% bei 100 ppm und weniger als 10% bei 10 ppm – ein Beleg für die gute Reproduzierbarkeit der Methode. Ein weiterer Vorteil kommt hinzu: Die LC-MS/MS Allergen-Screens können im Gegensatz zu ELISA-Techniken simultan für verschiedene Proteine durchgeführt werden.

Literatur

[1] FLUGS-Fachinformationsdienst der Helmholtz Zentrum München (2008). http://www.helmholtz-muenchen.de/flugs

[2] R. S. Kagan, “Food Allergy: An Overview”, Environmental Health Perspectives vol. 111, pp.223-225, 2003.

[3] J. Heick et al., “First screening method for the simultaneous detection of seven allergens by liquid chromatography mass spectrometry“, Journal of Chromatography A, vol.1218, pp. 938-943, 2011.

[4] M. Careri, et al., “Determination of peanut allergens in cereal-chocolate-based snacks: metal-tag inductively coupled plasma mass spectrometry immunoassay versus liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry”, Rapid Commun. Mass Spectrom., vol. 22, pp. 807-811, 2008.

[5] A. Colombini, et al., 1st MS Food Day, Parma, Italy, 2009.

[6] S. Lock, et al. “The Detection of Allergens in Bread and Pasta by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry”, AB SCIEX, Publication number: 1830610-01, 2010.

* *A. Schreiber: AB Sciex, Concord, ON, L4K 4V8, Canada

(ID:30882240)