Die Dosis macht die Wirkung HPLC-Multianalyse von Antibiotika im Therapeutischen Drug-Monitoring

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Schwerwiegende bakterielle Erkrankungen mit Antibiotika zu behandeln, zählt zum Standardinstrument der Medizin. Ist die Dosis zu hoch oder zu niedrig, kann es zu gravierenden Problemen kommen, bis hin zum Tod des Patienten. Um dies zu vermeiden, hat sich das Therapeutische Drug-Monitoring etabliert.

Im Jahr 1928 entdeckte Alexander Fleming durch einen Zufall das Penicillin, die Geschichte des Antibiotikums war geboren. Erstmals stand ein Mittel gegen bakterielle Erreger zur Verfügung, und viele sonst tödliche Krankheiten bedeuteten nicht mehr den sicheren Tod. Seither sind die Todesfälle und kritisch verlaufenden Krankheitsbilder drastisch zurückgegangen. Allerdings haben durch den häufigen Gebrauch einige Keime Resistenzen gegen Antibiotika entwickelt – die gängigen Mittel wirken häufig nicht mehr. Daher wurden viele weitere entwickelt und entdeckt.

Das Therapeutische Drug-Monitoring

Die Therapie mit Antibiotika kann auch unerwünschte Wirkungen haben. Nach der Arzneimittelgabe steigt der Spiegel im Blut an und wird durch den körpereigenen Metabolismus wieder abgebaut. Dieser Prozess ist je nach Patient unterschiedlich ausgeprägt, weshalb Einheitsdosen zur Über- oder Unterdosierung führen können (s. Abb. 1).

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Ist der Antibiotika-Spiegel zu hoch, nehmen die Nebenwirkungen stark zu, die Nieren werden zusätzlich belastet und es kann zu sehr kritischen Krankheitsverläufen kommen. Ist der Spiegel zu gering, wirkt das Medikament nicht optimal und Erreger vermehren sich weiter: Das Krankheitsbild schreitet voran. Bleiben nach der Therapie Erreger zurück, fördert das die Bildung von resistenten Keimen. Daher hat sich z.B. in der Intensivmedizin das Therapeutische Drug-Monitoring (TDM) etabliert, bei dem der Antibiotika-Spiegel jedes Patienten bestimmt und individuell eingestellt wird.

Die Einstellung des Medikamenten-Spiegels

Nach der Gabe einer Initialdosis wird der Wirkstoff-Spiegel im Blut bestimmt und die Dosis angepasst. Mit einer weiteren Messung wird die zu erreichende Zielkonzentration bestätigt oder weiter korrigiert. Sollte während der Behandlung eine Veränderung anderer Laborwerte auftreten, die die Metabolisierung des Antibiotikums beeinflussen, z.B. der Nierenwert, kann die Dosierung ebenfalls neu eingestellt werden. Auf diese Weise wird die Dosisgabe individuell justiert und die Behandlung mit Antibiotika erfolgt im optimalen Konzentrationsbereich. Die Nebenwirkungen und kritisch verlaufende Krankheitsbilder werden minimiert.

Für die Verabreichung von Antibiotika in der Intensivmedizin wird das TDM schon seit längerem in nationalen und internationalen Leitlinien gefordert und teilweise schon erfolgreich umgesetzt. Aufgrund der geringen chemischen Stabilität der Proben und der notwendigen schnellen Verfügbarkeit der Ergebnisse bei kritischen Krankheitsverläufen, scheidet die Vergabe der Messungen an externe Dienstleister in den meisten Fällen aus. Daher erfolgt die Bestimmung des Antibiotika-Spiegels zumeist direkt in den Kliniken. Als Methode der Wahl hat sich die HPLC mit UV-Detektion etabliert.

Entwicklung einer HPLC-Multimethode

Zusammen mit einer klinischen Apotheke wurde eine Multimethode entwickelt, um mehrere Antibiotika in einem Verfahren simultan zu bestimmen. Die neun wichtigsten Antibiotika für die Intensivmedizin (Cefepim, Meropenem, Ceftazidim, Ampicillin, Cefotaxim, Piperacillin, Cefazolin, Linezolid, Cefuroxim) wurden mit Coffein als internen Standard gemessen. In der Vergangenheit erfolgte die Bestimmung der Antibiotika in vielen Einzelmethoden, die jeden Morgen kalibriert und überprüft werden mussten – ein erheblicher zeitlicher Aufwand. Außerdem erfordert jede Technik einen einzelnen Standard, der hergestellt und stabil gelagert werden muss. Da häufig eine Kombination aus Antibiotika verabreicht wird, sind mehrere Messungen für eine Probe notwendig. Eine Multimethode zu etablieren, sollte den Messaufwand vereinfachen und zudem robust sein. Zu Beginn der Methodenentwicklung wurden einige Säulen ausgewählt und mit einer Standardmethode getestet. Die Wahl fiel auf eine Standard C18-Phase mit hoher Peak-Kapazität. Für die Messungen zum Säulen-Scouting wurde ein Multistandard in Schafserum hergestellt.

Es zeigte sich schnell, dass das Ciprofloxacin im Einzelstandard zwar stabil ist, sich im Multistandard aber schnell zersetzt. Daher wurde das Ciprofloxacin in einem zweiten Standard ausgelagert. Ebenfalls zeigte sich während der Methodenentwicklung, dass es bei Cefazolin und Linezolid zu Co-Elutionen kommt. Basislinienschwankungen erschwerten die Auswertung der meist sehr niedrig konzentrierten Antibiotika. Die Kritischen wurden mit den Anderen in einer weiteren schnellen isokratischen Methode ausgelagert; sie entspricht den Anfangsbedingungen der Gradienten-Multimethode. So ist auch die Messung dieser Substanzen während einer Sequenz möglich, ohne die Säule neu zu equilibrieren oder umzuspülen.

Die auf der Intensivstation gewonnenen Blutproben werden zentri­fugiert und Coffein als interner Standard hinzugefügt. Nach einer Proteinfällung wird ein Aliquot mit Acetonitril und Wasser verdünnt und die Probe durch einen Spritzenvorsatzfilter in ein HPLC-Vial fi­ltriert. Die Kalibrierung der Methoden erfolgt mit Standards, die in Schafserum angesetzt und tiefgefroren aufbewahrt werden.

Neue Methode gemäß ISO-Standard

Die Bedingungen der fertigen Methode sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Messungen erfolgten auf der kompakten HPLC Nexera-i von Shimadzu. Als Trennsäule diente eine Shim-pack XR ODS III, die eine sehr hohe Peak-Kapazität besitzt und auch bei matrixbehafteten Proben sehr robust ist. Als mobile Phase wurden Acetonitril und Wasser, jeweils angesäuert, verwendet. Abbildung 3 zeigt das Chromatogramm der Gradienten-Multimethode und Abbildung 4 die kurze isokratische Methode.

Die fertigen Techniken wurden nach den Richtlinien der GTFCh (Gesellschaft für Toxikologische und Forensische Chemie) anhand der ISO 5725 überprüft und validiert. Die fertigen Methoden sind für die Zukunft ein Grundstein zur Implementierung weiterer Antibiotika. Mithilfe der Co-Injektion der Nexera-i lassen sich auch kritische und im Multistandard nicht stabile Antibiotika integrieren.

Einfach, robust und ortsnah durchzuführen

Die entwickelte Methode ist eine einfache und robuste Möglichkeit, den Antibiotika-Spiegel zu bestimmen für eine rationale, wirksame antiinfektive Therapie lebensbedrohlicher Entzündungen. Einheitsdosen führen nicht mehr zu Über- oder Unterdosierung, und kritische Krankheitsverläufe lassen sich verhindern. Auch Kosten und der Antibiotikaverbrauch können so optimiert werden. Durch die einfache und kompakte HPLC Nexera-i können die Messungen ortsnah im Klinikum erfolgen. Dies ist aufgrund der chemischen Instabilität der Proben unerlässlich. Die Ergebnisse sind zeitnah verfügbar, was vor allem für schwerkranke Patienten von großem Interesse ist. Insbesondere in der Anfangsphase der Therapie ist das Monitoring über die Standard-Laborparameter nur bedingt aussagekräftig.

In Kombination mit der HPLC-Multimethode ermöglicht die Nexera-i auch für kleine Kliniken mit begrenzter Mitarbeiterzahl und geringem finanziellen Spielraum, das TDM in die Routine als Standard­instrument zu etablieren. Die entwickelte HPLC-Multimethode erfüllt alle Anforderungen an eine routinetaugliche, robuste Methode. n

* Dr. S. Vosskötter Shimadzu Deutschland GmbH, 47269 Duisburg

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