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Zuckeranalytik

Kohlenhydrate und Anionenaustauschchromatographie

| Redakteur: Christian Lüttmann

Die HPLC ist eine Standardmethode für viele Analytische Untersuchungen. Doch wenn es um die Bestimmung von Zuckern geht, schwächelt die Methode – insbesondere die Detektion der Zuckermoleküle gestaltet sich als schwierig und erfordert zusätzlichen Aufwand. Eine Alternative ist das Chromatographiesystem der Firma Knauer mit gepulster amperometrischer Detektion.

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Das Zuckeranalyse-Chromatographiesystem von Knauer
Das Zuckeranalyse-Chromatographiesystem von Knauer
(Bild: Knauer)

Kohlenhydrate gehören zu den am weitesten verbreiteten organischen Verbindungen in der belebten Natur. Als Mono- und Di-Saccharide dienen sie vornehmlich der direkten Energieversorgung im Organismus. Als Oligomere oder Polymere sind sie eher Speicherform für Energie oder Informationen oder übernehmen Aufgaben als Strukturelement in Zellwänden vornehmlich von Pflanzen. Wegen ihrer großen Bedeutung im Bereich der ökologischen, biologischen, klinischen und Ernährungsforschung ist die Bestimmung von Zuckern und anderen Kohlenhydraten von hohem Interesse. Es gibt eine Reihe unterschiedlicher Bestimmungsmethoden, die oftmals apparativ kostspielig sind, wie beispielsweise HPLC-MS, oder kompliziert in der Durchführung, wie GC mit Derivatisierung.

Standard-HPLC im Nachteil

Man mag sich die Frage stellen, weshalb keine Standard-HPLC für die empfindliche Zuckeranalytik genügt. An der Trennung der Zucker liegt es nicht. Diese gelingt auf einem HPLC-System mithilfe der Hochleistungs-Anionenaustauschchromatografie (HPAEC) in guter Qualität, denn geringe Unterschiede in den pKa-Werten der Kohlenhydrat-Hydroxylgruppen bewirken mit stark alkalischen Eluenten eine unterschiedliche Retention der Saccharide an einem Anionenaustauscherharz.

Die Herausforderung liegt eher bei der Detektion. UV- oder Fluoreszenz-Detektion, die in der Flüssigkeitschromatografie weit verbreitet sind, können wegen fehlender Chromophore bei Zuckern in der Regel nicht eingesetzt werden. Brechungsindex-Detektion ist sehr einfach in der Anwendung, jedoch nur wenig empfindlich und somit nicht für die Bestimmung niedriger Zuckergehalte geeignet. Mit einem Derivatisierungsschritt, der einen Chromophor bildet, können die spektroskopischen Verfahren zwar für die Zuckeranalytik einsetzbar werden, dies benötigt jedoch zusätzliche Geräte, Chemikalien und Arbeitsschritte.

Die Amperometrie als Alternative

Ein alternativer Ansatz macht sich zunutze, dass Kohlenhydrate elektrochemisch reagieren. Dadurch lassen sie sich sehr empfindlich und selektiv amperometrisch detektieren.

Die Amperometrie gehört in der quantitativen Analyse zu den Bestimmungsmethoden mit sehr hoher Empfindlichkeit. Dabei wird ein Elektrolysestrom an einer Arbeitselektrode unter konstant gehaltenem elektrochemischem Potenzial gemessen. Der Elektrolysestrom ist proportional zur Konzentration des oxidierten/reduzierten Analyten. Die klassische Amperometrie ist ein diskontinuierliches Verfahren: Messung/Titration, Reaktor entleeren, reinigen, regenerieren, nächste Messung starten. In der HPLC ist sie daher so nicht direkt einsetzbar.

Schneller Regenerationszyklus erlaubt Chromatogramm-Zeichnung

Im Zuckeranalyse-Chromatographiesystem von Knauer kommt gepulste amperometrische Detektion (PAD) zum Einsatz, eine Variante, die eine schnelle Messung inkl. der bei Zuckerdetektion notwendigen Regeneration der Elektrode in einer kleinen Messzelle ermöglicht. Ein Zyklus aus Messung, Desorption und Regeneration der Elektrode benötigt nach Angaben des Unternehmens nur eine halbe Sekunde und wird während der Analyse ständig wiederholt. So kann wie bei anderen Durchflussdetektoren ein Chromatogramm mitgezeichnet werden. Das Verfahren braucht außer dem frisch bereiteten wässrigen basischen Eluenten keine zusätzlichen Chemikalien, heißt es in einer Pressemeldung.

Anwendungsbeispiel: Holzanalyse

Für die Analyse von Monosacchariden und Uronsäuren, die aus Holz gewonnen wurden, sind empfindliche Methoden nötig.
Für die Analyse von Monosacchariden und Uronsäuren, die aus Holz gewonnen wurden, sind empfindliche Methoden nötig.
(Bild: algria / Pixabay)

In der Forschung für regenerative Roh- und Treibstoffe, die nicht in Konkurrenz zur Nahrungsmittelerzeugung stehen sollen, spielen Zucker aus Holz- und Pflanzenabfällen eine wichtige Rolle. Um die Prozesse zu überwachen oder die Qualität der Produkte zu ermitteln, ist eine empfindliche und zuverlässige Analytik notwendig.

Im vorliegenden Beispiel, das die Firma Knauer in einer Pressemeldung beschreibt, wird ein Gemisch aus sieben Monosacchariden und zwei Uronsäuren, die aus Holz gewonnen wurden, mit der Hochleistungs-Anionenaustausch-Chromatografie (HPAEC) basisliniengetrennt und per mit gepulster amperometrischer Detektion (PAD) mit sehr hohem Signal/Rausch-Verhältnis bestimmt.

Mit unterschiedlichen NaOH-Konzentrationen eignet sich die Methode für eine einfache und reproduzierbare Analyse, auch bei geringen Analyten-Konzentrationen, heißt es von Knauer. Neben der Erforschung von Biokraftstoffen sind die untersuchten Zucker auch Bestandteile zahlreicher Prozesse in Lebensmittelanwendungen und der Natur. Somit soll sich diese Applikation für verschiedene Bereiche eignen, in denen Kohlenhydrate spezifisch getrennt und analysiert werden müssen.

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