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Probenvorbereitung Mehrere Zellsuspensionen zeitgleich aufschließen

Autor / Redakteur: Tanja Hanke* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Vor der Analyse steht die Probenvorbereitung. Gerade die Arbeit mit lebenden Zellen erfordert hier besondere Aufmerksamkeit. Lesen Sie, wie Sie mit einer speziellen Schwingmühle Hefezellen oder Mikroalgen effizient aufschließen können.

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Abb. 1a: Zellen der Mikroalge Phaeodactylum tricornutum vor dem Aufschluss
Abb. 1a: Zellen der Mikroalge Phaeodactylum tricornutum vor dem Aufschluss
(Bild: Retsch)

Eine wichtige Methode in der biologischen Grundlagenforschung, der angewandten Biotechnologie oder medizinischen Forschung ist der Zellaufschluss von Bakterien und Hefen, um die Nukleinsäuren (DNA und RNA) oder die Zellproteine zu untersuchen. Für die Isolierung von DNA oder RNA wird meist nur eine kleine Menge Zellmaterial von unter 1 ml benötigt. Für die Extraktion von Proteinen aus Bakterien, Hefen, Pilzen oder Algen jedoch braucht man häufig größere Mengen Zellsuspension. Eine sehr effiziente Aufschlussmethode ist das so genannte „Bead Beating“, bei dem kleine Glaskugeln in Reaktionsgefäßen Zellsuspensionen durch mechanische Effekte aufschließen. Häufig wird das Reaktionsgefäß dabei über einen Vortexer gehalten, sodass die Zellsuspension mit den Glaskügelchen im Gefäß aufgewirbelt wird und so die Zellen aufgeschert werden. Bei größeren Probendurchsätzen oder längeren Aufschlusszeiten von bis zu zehn Minuten ist diese Methode jedoch zeitaufwändig und fehleranfällig. Reproduzierbarer und schneller geht es mit einer Schwingmühle MM 400 von Retsch kombiniert mit dem Falcon-Tube Adapter, der bis zu acht Falcons gleichzeitig fassen kann. Dies wird im Folgenden am Beispiel von Hefezellen (Saccharomyces cerevisiae) und Mikroalgen (Thalassiosira pseudonana und Phaeodactylum tricornutum) gezeigt.

Hefesuspensionen aufschließen

Die Abteilung der Systembiochemie der Ruhr-Universität Bochum beschäftigt sich mit Zellbestandteilen, den so genannten Peroxisomen. Diese sind u.a. an Abbauprozessen von Fettsäuren in eukaryotischen Zellen beteiligt. Ist die Funktion der Peroxisomen gestört, kann das zu schweren Stoffwechselstörungen führen. Um die Funktionsweise der Peroxisomen besser zu verstehen, untersucht die Promotionsstudentin Anna Chan Transportprozesse von Zellinhaltsstoffen in und aus den Peroxisomen am Beispiel des Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae. Hierzu ist es nötig, größere Volumina von ca. 20 ml Zellsuspension aufzuschließen, um dann die Funktionalität bestimmter Zellproteine untersuchen zu können. Bisher erfolgte der Zellaufschluss im Institut durch einfaches Vortexen von jeweils 4 g Hefen mit 12 g Aufschlusspuffer und 16 g Glaskugeln (0,5 bis 0,75 mm Durchmesser) im 50-ml-Falcon für 12 x 1 min mit 1 min Zwischenkühlung auf Eis. Sollten mehrere Proben parallel aufgeschlossen werden, mussten viele Personen an mehreren Vortexern zeitgleich arbeiten. Außerdem war ein Wechsel der Proben zwischen den einzelnen Personen notwendig, um geräte- und personenbedingte Unterschiede auszugleichen.

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Eine deutliche Arbeitserleichterung stellt für Anna Chan der Einsatz der Schwingmühle MM 400 mit dem Adapter für bis zu acht konische Falcon-Tubes dar. Mit dieser Mühle können mehrere Proben gleichzeitig bei 30 Hz automatisiert aufgeschlossen werden. Zur Methodenvalidierung verglich Chan den Gesamtproteingehalt der Zellsuspension nach Vortex-Aufschluss mit dem nach Aufschluss mit der MM 400, ebenso wie die Temperaturentwicklung und die Reproduzierbarkeit (s. Abb. 2 und 3).

Bereits nach sechs bis sieben Minuten wurde beim Zellaufschluss in der MM 400 bei 30 Hz die gleiche Menge Gesamtprotein gemessen wie nach zwölf Minuten manuellem Vortex-Aufschluss. Zudem betrug der Temperaturanstieg der Zellsuspension aus der MM 400 nur etwa 8 °C gegenüber 14 °C beim Vortex-Aufschluss. Der Vergleich erbrachte außerdem, dass die Methode mit der MM 400 mit einer Standardabweichung von 0,2 bis 4% deutlich reproduzierbarer abläuft als das manuelle Vortexen mit einer Standardabweichung von 0,9 bis 9%.

Der Aufschluss mit Glasbeads von 0,75 bis 1,00 mm Durchmesser kann zu etwas besseren Aufschlussergebnissen führen. Außerdem ist es bei der Extraktion von Proteinen positiv, die Aufschlussgeschwindigkeit von 30 Hz auf 20 Hz zu reduzieren, um die Schaumbildung zu vermindern, was gleichzeitig zu höheren Mengen an Gesamtprotein in der aufgeschlossenen Zellsuspension führt, und die Temperaturerhöhung geringer hält (s. Abb. 4). Chan konnte außerdem durch enzymatischen Aktivitätstest zeigen, dass die Proteine funktionell extrahiert werden konnten.

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