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KITS & ARRAYS

Microarrays werden erwachsen

| Autor/ Redakteur: Helmut Bruckner* / Gerd Kielburger

Für die Entwicklung von Pharmawirkstoffen und Diagnostika wurden und werden immer raffiniertere Microarrays ausgetüftelt. Nun verlassen die ersten Biochips die Welt der Forschungslabors, um zu alltäglichenRoutinewerkzeugen in Klinik und Arztpraxis zu werden.

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( Archiv: Vogel Business Media )

Für die Entwicklung von Pharma-wirkstoffen und Diagnostika wurden und werden immer raffiniertere Microarrays ausgetüftelt. Nun verlassen die ersten Biochips die Welt der Forschungslabors, um zu alltäglichen Routinewerkzeugen in Klinik und Arztpraxis zu werden.

Seit zehn Jahren wird an und mit Microarrays experimentiert. Nun verlassen sie allmählich die Spielwiesen der Forscher, machen sozusagen die ersten Schritte ins richtige Leben. Konzipiert als Hochdurchsatz-Instrumente bewährten sich die Biochips für Vergleichsstudien, wie beim Gen-Expressions-Profiling. Für solche grundlegenden Forschungsarbeiten in Medizin und Pharmazie, bei denen Aktivitätsmuster von Genen in Organismen, Geweben und Zellen analysiert werden, wurden kürzlich der CGH-Chip von Agilent, der Rat-Chip von Ocimum Biosolutions sowie der Ab-Mikroarray von BD Biosciences entwickelt.

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Weitere Anwendungsgebiete finden Microarrays neuerdings aber auch in der Krankheitsdiagnostik, etwa bei der Typisierung von Krebsformen und der Identifizierung von Infektionserregern, und für pharmakogenetische Tests, die bei der Auswahl der richtigen Arzneimittel helfen. Zu diesen Diagnose-Chips gehören der AmpliChip CYP450, unlängst von Roche auf den Markt gebracht, und der in Zahnarzt-Praxen verwendete ParoCheck von Greiner BioOne, der mit Array-basierten Mundflora-Analysen Neuland betritt.

Unterwegs in die Praxis

Der von Roche Diagnostics entwickelte, auf Affymetrix-Technologie aufbauende AmpliChip CYP450 enthält 33 CyP450-Mutationsvarianten [1]. Das im Chip-Namen enthaltene Kürzel CYP bezeichnet Cytochrom P-450, eine Familie von Stoffwechsel- enzymen, deren Mitglieder eine wichtige Rolle beim Abbau von endogenen und exogenen Substraten, wie kanzerogenen Substanzen und Arzneistoffen, spielen. Durch ihre Aktivität beeinflussen einzelne Cytochrom P450-Varianten die Wirkdauer und -intensität von schätzungsweise 25 Prozent der bekannten Medikamente. Mithilfe dieses Diagnose-Chips werden derzeit in zahlreichen klinischen Untersuchungen Nebenwirkungen und Wirksamkeitschwankungen von Medikamentenwirkstoffen getestet.

Seit Juni 2005 wenden beispielsweise das Zentrum für Humangenetik und Laboratoriumsmedizin und der Biotech-Dienstleister IMGM Laboratories in Martinsried den AmpliChip-CYP450 an. Im Rahmen der humangenetischen Diagnostik werden dort allerdings keine breitangelegten Screenings durchgeführt, sondern Anfragen zu Einzelfällen aus Kliniken oder ärztlichen Praxen bearbeitet. Untersucht werden Patienten, bei denen ein bestimmtes Medikament in der Standarddosierung nicht anspricht oder zu erheblichen Nebenwirkungen führt. In solchen Fällen wird zunächst DNA aus einer Patientenprobe (Blut und Schleimhauttupferabstrich) extrahiert.

Diese DNA wird mittels PCR (Polymerasekettenreaktion) vervielfältigt und die Sequenz dann durch herkömmliche Verfahren analysiert (Stufe I). Liegt eine genetische Disposition für die unerwünschte Arzneimittelwirkung vor, lässt sich in etwa zwei Dritteln der Fälle bereits auf diesem Wege die Ursache für den verlangsamten oder beschleunigten Metabolismus des Arzneimittels eruieren. Ist das nicht der Fall, wird der AmpliChip-CYP450 für eine erweiterte Analyse (Stufe II) herangezogen. Hierdurch lassen sich mehr als 30 Varianten des Cytochrom-P450-Systems erfassen. Von besonderer Relevanz sind hierbei Allelvarianten aus dem CYP2D6- und dem CYP2C19-Gen, die häufig Ursache für die unterschiedlichen Metabolisierungstypen sind. Die Ergebnisse der AmpliChip-CYP450-Tests erlauben derzeit nur Interpretationen von Monotherapien. Bei gleichzeitiger Gabe mehrerer Medikamente ist die Pharmakokinetik zu komplex, um eindeutige Vorhersagen nur auf Basis des Genotyps treffen zu können.

Den Praktiker interessiert natürlich besonders die Frage, welche Dosisempfehlungen sich aus den molekulargenetischen Befunden ableiten lassen. Hier gibt es bereits bei zahlreichen Neurolepktika und Antidepressiva Empfehlungen. Bei anderen Medikamentenklassen sind zurzeit noch keine entsprechenden Angaben auf Grundlage des Genotyps möglich.

Im Übrigen ist darauf hinzuweisen: Die Interpretation der Chip-Ergebnisse und die pharmakogenetische Beratung des einsendenden Arztes gehören in die Hand erfahrener Pharmazeuten oder klinischer Pharmakologen. Ein wichtiges Hilfsmittel auf dem Weg zu Dosisempfehlungen ist die von IMGM Laboratories in Zusammenarbeit mit der Roten Liste entwickelte, Internet-basierte Datenbank DrugProfiler, in der pharmakogenetisch relevante Daten von Medikamenten gesammelt und für den Arzt und Apotheker leicht und verständlich zugänglich gemacht werden.

Ein Test in aller Munde

Ebenfalls bereits in der ärzlichen Praxis angekommen ist ein Array von Greiner Bio-One. Die Firma bietet den ersten DNA-Chip zum Nachweis von Bakterienarten, die mit Parodontitis assoziiert sind. Zum Hintergrund: Die gesunde Mundflora enthält etwa 500 verschiedene Spezies, von denen die meisten nicht pathogen sind. Doch unter bestimmten Umständen, bei schlechter Zahnpflege oder einem geschwächten Immunsystem, können die gefährlichen Arten überhand nehmen. Die Stoffwechselgifte dieser Mikroorganismen rufen dann meist Entzündungsprozesse hervor, die in eine Parodontose münden können. Wird die Erkrankung des Zahnfleisches nicht konsequent und effektiv behandelt, ist am Ende nicht nur häufig der Verlust von Zähnen zu beklagen, auch ein gewisses Risiko für Herzerkrankungen und Schlaganfälle ist gegeben. Aus diesem Grund ist es wichtig, eine Verschiebung des mikrobiellen Keimspektrums in der Mundhöhle beizeiten zu erkennen.

Die klinische Diagnostik beschränkte sich bisher auf die bedeutsamsten Leitkeime, insbesondere auf den Nachweis des so genannten Roten Komplexes (T. forsythia, P. gingivalis und T. denticola). Doch sind, wie umfangreiche wissenschaftliche Studien gezeigt haben, mit diesen Leitkeimen oft Gruppen weiterer Bakterienspezies assoziiert, die zusammenwirken und das Pathogenitätspotenzial deutlich erhöhen [2]. Mit dem ParoCheck lassen sich nun simultan weitere wichtige Keime auf Basis eines DNA-Chips qualitativ erfassen. Das Test-Prinzip basiert auf dem Nachweis keimspezifischer 16S-rRNA-codierender DNA.

Die Proben sammelt der Zahnarzt schnell und einfach mithilfe eines Entnahme-Sets. Fachlabore übernehmen anschließend die Befunderstellung und geben Therapieempfehlungen. Die Analyse der Biochips erfolgt in computer-gesteuerten, optisch hochauflösenden Mikroarray-Scannern. Die digitale Auswertung lässt sich problemlos archivieren und der Befund per E-Mail der Praxis zustellen. Mit ParoCheck Kit 10 werden alle Vertreter des Roten Komplexes und einige Vertreter des Orangen Komplexes (P. micros, C. rectus, P. intermedia, F. nucleatum) erkennbar, mit ParoCheck Kit 20 werden darüber hinaus fast alle Spezies des Orangen Komplexes sowie Leitkeime weiterer Komplexe erfasst.

Erste klinische Studien bestätigen, dass durch den ParoCheck der Verlauf der Parodontose-Therapie wesentlich effizienter gestaltet werden kann. Auf Grundlage der bakteriellen Bestandsaufnahme kann gezielt eine Kombination effektiver Antibiotika gegen das gefundene Keimspektrum bestimmt werden.

Rat on a Chip

Vor kurzem ist ein für Expressionsanalysen konzipierter Mikroarray der Firma Ocimum Biosolutions auf dem Markt erschienen: Der OciChip Rat 30K-Array baut auf dem 10K Ratten-Array der MWG Biotech auf, in dem bereits über 400000 EST-Sequenzen abgebildet waren. Der neue Mikroarray deckt mit 28067 Features das gesamte Rattengenom ab und basiert dabei auf der Totalsequenzierung des Rattengenoms durch Gibbs [3] im letzten Jahr. Laut Hersteller verfügt dieser Chip damit über „die aktuellste Datengrundlage aller Ratten-Arrays auf dem Markt”.

Die OciChip DNA-Arrays basieren auf hochreinen Oligonucleotid-Sonden mit einer Länge von 50 Nucleotiden, die nach der Synthese zur Qualitätskontrolle mit MALDI-TOF MS getestet werden. Die Länge von 50-meren stellt - so das Ergebnis zahlreicher Studien - den optimalen Kompromiss zwischen Sensitivität und Spezifität dar. Damit lassen sich auch Spliceformen von Transkripten differenzieren, die sich nur in kurzen Exons unterscheiden. Die Oligos werden beim Drucken über einen Amino-Linker kovalent an die Epoxy-Schicht von Glas-Slides gebunden.

Für die Qualitätskontrollen sind in das Array-Layout zahlreiche Kontroll-Oligos in einem wiedererkennbaren Muster eingebaut. Dadurch werden falsche Platzierungen von Oligonucleotiden oder Carry-over-Effekte auf einen Blick erkennbar. Des Weiteren sind mehrere Oligonucleotide, die Housekeeping-Gene repräsentieren und als Positiv-Kontrollen fungieren, an passenden Positionen ins Layout eingefügt. Hervorzuheben ist auch, dass alle Sonden der Arrays und Oligosets des Herstellers neben BLAST zusätzlich auch mit Smith-Waterman-Algorithmen auf Anwesenheit ähnlicher oder redundanter Sequenzen hin abgeglichen werden. Auf diese Weise lässt sich der Umfang unerwünschter Cross-Hybridisierungen zusätzlich um 10 bis 15 Prozent verringern.

Der OciChip Rat repräsentiert über 90 Prozent des Genoms der klassischen Laborratte (Rattus norvegicus). Das, nach Mensch und Maus, dritte komplett sequenzierte Säugetiergenom erweitert die Möglichkeiten zu interspezifischen Vergleichen. Dadurch können die mit bestimmten Human-Erkrankungen in Beziehung gebrachten Gene und Proteine differenzierter analysiert werden. Bei der Abklärung unerwünschter Arzneimittelwirkungen werden im Rahmen toxikologischer Studien häufig Ratten verwendet. Daher bietet sich dieser Array insbesondere als Tool für Fragestellungen der experimentellen Medizin und für die Entwicklung von neuen Arzneiwirkstoffen an. Aber auch offenen Fragen zur Säuger-Evolution kann damit nachgegangen werden.

Tumorgenen auf der Spur

Die Firma Agilent hat den Human Genome CGH-Mikroarray entwickelt, mit dem man genomische Unterschiede aufspüren kann. [4] Die Abküzung CGH steht für vergleichende genomische Hybridisierung (Comparative Genomic Hybridization), eine Technik, mit der sich Veränderungen im Genommaterial nachweisen lassen. Mit dieser Methode können beispielsweise in Krebszellen häufig auftretende Deletionen oder Duplikationen von DNA-Abschnitten festgestellt werden. So lassen sich neue Onkogene und Tumorsuppressorgene ebenso identifizieren wie Arzneiwirkstoff-Targets und Biomarker. Diese sind dann für künftige diagnostische Anwendungen und Subklassifikationen von Krankheiten einsetzbar. Der Human Genome CGH Mikroarray (G2519A) repräsentiert das ganze Genom, wobei schwerpunktmäßig die am besten untersuchten codierenden Sequenzen und die mit der Krebsentstehung in Beziehung gebrachten Gene erfasst werden.

Der Array beinhaltet 40000 Proben, die das Humangenom mit einer durchschnittlichen räumlichen Auflösung von 75 kb umspannen, codierende und nicht-codierende Sequenzen eingeschlossen. Enthalten ist eine Probe pro Gen aus den Datenbanken RefSeq und GenBank sowie drei Proben für jedes der etwa 1100 als wichtig bekannten Krebsgene. Die weiteren Proben decken das restliche Genom ab, mit einem Schwerpunkt auf den weniger bekannten und den prognostizierten Gensequenzen aus öffentlich zugänglichen Datenbanken. Der CGH-Microarray verwendet 60-mere Oligonucleotid-Proben, was ihm eine sehr hohe Sensitivität verleiht. Der Anwender erfasst damit gehäuft auftretende Deletionen (hot spots) und ausgedehnte Einzeldeletionen ebenso wie homozygote Gendeletionen und Amplikons. Um solche chromosomalen Veränderungen zu identifzieren, sind für das Arbeiten mit dem CGH-Array nur 25 Nanogramm der genomischen Gesamt-DNA erforderlich. Eine spezielle Analytik-Software (G4175AA) erlaubt die Auswertung und Darstellung der CGH-Array-Daten.

Auch Proteine profilieren sich

Aufgrund des wachsenden Interesses an Proteinprofilen werden immer größere und umfassendere Antikörper-Arrays entwickelt. Der Antibody-Microarray 500 von BD Biosciences gehört in diese Reihe. Er beinhaltet mehr als fünfhundert monoklonale Antikörper und ist für die Analyse von Protein-Expressionsmustern in Zellen, Geweben und Körperflüssigkeiten gestaltet. Alle verwendeten Antikörper wurden auf Spezifität und Sensitivität geprüft.

Eine Analyse mit diesem Antikörper-Microarray beginnt mit der Proteinextraktion unter nicht denaturierenden Bedingungen - einem One-step-Verfahren. Als Ausgangsmenge für eine Probe werden gerade mal 2000 bis 10000 Zellen oder 1 µg Gesamtprotein, zum Beispiel aus Gewebe, benötigt. (Diese Zahlen gelten für den Nanoscale Buffer Kit, der seit März diesen Jahres erhältlich ist). Damit hat der Kunde die Gelegenheit, auch kleinste Mengen an Ausgangsmaterial über diese Technik zu analysieren. Die Proben werden dann mit grünem Cy3- und rotem Cy5-Fluoreszenzfarbstoff markiert. Ungebundene Farbstoffe lassen sich durch einen einfachen Zentrifugationsschritt über so genannte FluorTrapMatrix-Säulchen entfernen und die markierten Proteine werden anschließend auf den Antikörper-Chip gebracht. Sämtliche Extraktions- und Markierungs-Reagenzien sowie die Hybridisierungskammer und spezielle Deckgläser sind Bestandteile des AB Microarray Buffer Kits (Cat. No. 631 791) beziehungsweise des AB Microarray Nanoscale Buffer Kits (Cat. No. 631 792).

Die auf Standardformat-Objektträger (75x25x1 mm) gedruckten Arrays sind mit den meisten kommerziell erhältlichen Fluoreszenz-Scannern auszuwerten. Die Detektionsgrenze liegt bei 20 pg/ml für jedes Proteintarget. Mit dem Aufbereiten der Daten kann wenige Minuten nach der Analyse begonnen werden. Die Zwei-Farben-Detektionsmethode ermöglicht einen Vergleich relativer Proteinmengen - beispielsweise aus Normal- und Tumorgewebe. Da die Fluoreszenzsignale mit den Mengen markierten Proteins korrespondieren, lässt sich das Verhältnis der beiden Proben errechnen. Daraus ergeben sich Hinweise, ob bestimmte Stoffwechselwege oder Gruppen von Proteinen betroffen sind.

Die Plattform befähigt ihren Anwender, hunderte cytosolischer und membrangebundener Proteine mit einem einzigen Experiment zu testen. Mit dem Antibody Microarray 500 wurden bereits Protein-Expressions-Profile erstellt, bei denen normale Muskelzellen mit Kulturen einer neuromuskulären Erkrankung (Spinal Muscular Atrophy, SMA) verglichen wurden. Hierbei zeigten neun Proteine - die sowohl als RNA-Bindungsproteine als auch als Transkriptionsfaktoren wirken - eine differentielle Expression. Kürzlich wurde der Array außerdem für Studien verwendet, bei denen die Expression von Regulationsproteinen bei Diabetes [5] und die transkriptionelle Regulation verschiedener Krebs-Marker [6] untersucht wurde.

Ausblick

Mit der zunehmenden Miniaturisierung werden die Inhalte der Arrays immer umfangreicher. Gegenwärtig wird bei Affymetrix ein DNA-Chip vorbereitet, der 6,5 Millionen Oligos enthalten soll. Mit solchen Contents werden ganz neue Dimensionen für Array-Analysen eröffnet: Bislang beschränkte sich bei solchen Studien der Umfang im Wesentlichen auf bekannte Gene sowie solche, bei denen eine (Krankheits-)Relevanz zu vermuten war. Künftig nun wird es möglich sein, zusätzlich auch die umfangreichen nicht-codierenden Bereiche von Genomen mit einem einzigen Array zu erfassen.

Das wird dazu beitragen, unsere Kenntnisse über Krankheitsprozesse auszuweiten, was wiederum Grundlage ist für die Entwicklung immer differenzierterer Diagnose-Chips. Um den POC-Sektor, also den unmittelbaren und autonomen Einsatz von Biochips in Kliniken und Arztpraxen zu erreichen, müssen Biochips für diagnostische Fragestellungen allerdings noch einfacher handhabbar und kostengünstiger werden. Zusätzlich wünscht sich die Scientific Community eine größere Standardisierung hinsichtlich Qualität und Reproduzierbarkeit der Arrays. Doch ob dem von Seiten der Hersteller so bald entsprochen wird, da bleibt ein deutliches Fragezeichen.

*Dr. H. Bruckner, Redaktionsbüro BioScript, München

Literatur:[1] Vetter, “AmpliChip CYP450: Erster Genchip für die klinische Routine”, Deutsches Ärzteblatt 102, März 2005, Ausgabe 9, 606.[2] Socransky, Haffajee, “Dental Biofilms: difficult therapeutic targets”, Periodontology 2000, Vol. 28, 2002, 12-55.[3] Gibbs et al.: “Genome sequence of the Brown Norway rat yields insides into mammalian evolution”, Nature; 2004; 428 (6982), 493-521.[4] Barrett et al., “Comparative genomic hybridization using oligonucleotide Microarrays and total genomic DNA”, PNAS, 2004, Vol. 101, 17765 – 17770.[5] Gosmanov et al., “Impaired expression and insulin-stimulated phosphorylation of Akt-2 in muscle of obese patients with atypical diabetes”, Am J Physiol Endocrinol Metab, 2004, 287 (1), E8-E15.[6] Marienfeld et al., “Translational regulation of XIAP expression and cell survival during hypoxia in human cholangiocarcinoma”, Gastroenterology, 2004, 127 (6), 1787-1797.

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